细胞工程五节　植物细胞培.pptVIP

第五节　植物细胞培养的应用 一、筛选突变体 二、生产植物次生代谢产物 本章几个基本概念 体细胞：生殖细胞以外的细胞。 体细胞无性变异株：是一株由体细胞经无性过程培养发生的体细胞变异植株。 突变体：经过突变而产生的新个体。 嵌合性：同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞，它是组织培养中常见的现象。 嵌合体：同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞的个体。 一、筛选突变体 （一）植物细胞培养与突变体筛选 由于生物体突变频率低， 植物基因突变频率一般为10-7，且绝大多数为有害突变。在自然界发现适合于我们人类需要的性状突变是很难的，即使是出现了也常常是嵌合体而难以利用. 而单细胞培养，不仅提高了突变率，也可利用细胞的全能性分离培养获得突变体（mutant）。 诱变处理的单倍体体细胞在基本培养基中培养96小时，有营养缺陷的细胞不能继续生长，只有野生型细胞生长旺盛。 此时把BUdR加入培养基，暗培养36hr， BUdR只能与活跃生长的细胞中的DNA结合，并使与其结合的DNA获得光敏特性，因此当把培养物再转到光下时，引起在基本培养基上生长的那些细胞DNA严重损伤，突变细胞不结合BUdR。 将两种细胞转入完全培养基，只有突变细胞才能繁殖，再经过二倍化处理，可得到纯合二倍体突变系。 自发突变和诱发突变 突变可以是自发产生（自发突变），也可以受诱变剂诱发产生（诱发突变）。 影响突变频率的因素包括植物的遗传基因型、年龄、细胞和组织继代培养的时间、培养部位、培养基的组成和培养的环境条件等。 1．诱变剂的选择 植物细胞的诱变因素与微生物细胞的基本相同。 诱变剂可分物理和化学的两大类型。 ⑴ 物理诱变 物理诱变主要是通过射线．磁场以及温度等对培养物进行一定处理，然后对处理后的 培养物进行培养筛选。常用的射线处理包括X射线．γ射线．快中子（高能粒子）．紫外线等。其中紫外线诱变不需要昂贵的设备，一般实验室都可以应用。 ⑵ 化学诱变 化学诱变是通过在培养基中添加一些化学物质，细胞对这些化学物质吸收后直接或间接引起碱基突变。 ① 烷化剂 ② 碱基类似物 ③ 移码诱变剂，如ICR化合物和吖啶类似物等；④ 其它如亚硝酸．羟胺等某些抗菌素亦可引起突变产生。 化学诱变剂都是一些结构复杂的试剂，一般都有毒性，大多有致癌作用，因此操作起来要特别小心。 2．诱变材料的选择 选择起始材料需根据试验目标确定，一般需考虑以下几方面的问题：⑴ 目标性状的可行性。⑵ 必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平，只有对起始材料有良好的培养技术，才有可能制定完满的诱变及选择方案。⑶ 适当的细胞类型亦是提高体细胞突变系筛选效率的重要条件。 （二）突变体的类型 目前，已筛选到遗传变异植物主要有以下几类：抗寒．抗旱．耐盐．营养缺陷型．抗氯酸盐．抗氨基酸．抗抗菌素类药物．抗除草剂和抗病虫性植物的新品种。 其中，营养缺陷型．抗氯酸盐和抗抗菌素类药物的突变体，已被广泛应用于遗传学和基因工程的研究之中。 （三）突变体的筛选方法 通常采用的筛选方法有正筛选系统、负筛选系统和“绿岛法”选择三种。 1.正选择系统 正选择系统又称直接筛选系统，是在设计的选择条件下，能使培养细胞或再生个体获得直接感官上的差异，因此能将突变个体和非突变个体分离。 最直接的做法是用一种含有特定物质的选择培养基，可选用最适培养基并加入一些药物使突变体细胞能正常生长，而其他细胞不能生长，将变异了的细胞选择出来。 目前采用这一途径，已从多种植物中筛选出可利用的体细胞变异体。 2.负选择系统 这是一种很巧妙的筛选法也可叫做负选择法。这种方法是先用特定的培养基使发生遗传变异的细胞停止生长，而正常未发生突变的细胞可以生长； 这时加入一种可以杀死正在生长的细胞而对不生长细胞无害的药物（一种能使生长的细胞中毒死亡的汰选剂），淘汰去这些细胞，然后再改变条件，使处于停止生长状态的未杀死的突变细胞重新恢复生长；这样就可以只保留期望得到的变异细胞。 3．“绿岛法”选择法 　对于抗病毒突变体．抗除草剂突变体的筛选，可以采用“绿岛法”。这种方法最早用于抗除草剂，叶片大面积枯黄，仅有少量抗除草剂突变细胞组织仍保持绿色，取这部分材料则成为很小的绿岛，因而形象地称之为“绿岛法”。 二、生产植物次生代谢产物 细胞培养物的某些次生化合物含量有的比植物体高出2-5倍。 生物转化率高 细胞培养物给细胞提供一般情况下植物所不具备的底物化合物； 提供植物天然产物的中间体，以期提高天然化合物产量，从而提高次生代谢产物。 （一）植物次生代谢产物的种类 从植物提取的有机物包括初生代谢物和次生代谢物两大类。初生代谢物与植物生长、发育、繁殖直接相关，是植物获得能量的代谢，为植物体生存、生长、发育、繁殖提供能量和中间产物。 植物次生代谢产物是指植