高效液相色法概论课件.pptVIP

高效液相色谱法 HPLC 一 概 述 1、历史 2、特点 3、方法局限性 4、与气相色谱比较 5、与经典LC比较 6、色谱学文献 1、历 史 1903年 色谱法问世 1931年 库恩（Kuhn）分离胡萝卜素 1941年 马丁（Martin）和辛格（Synge）提出液液分配色谱法 1958年 美国生物化学家斯坦因(W.H.Stein)和莫尔（Moore）研制出氨基酸分析仪 60年代末，70年代初，高效液相色谱仪的成功研制 色谱法问世 茨维特1903年3月21日，他在华沙自然科学学会生物学会议上发表了“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”研究论文，介绍了一种应用吸附原理分离植物色素的新方法，并首先认识到这种层析现象在分离分析方面有重大价值。 1906年他在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法Chromatography，茨维特被世人公认为色谱的创始人。 茨维特工作的主要贡献： ▲（采用吸附色谱）成功分离了叶绿素a和叶绿素b ▲ 发明了伟大的色谱法 库恩（Kuhn）分离胡萝卜素 1931年，德国的Kuhn和Lederer采用类似Tswett的柱色谱方法，采用纤维状氧化铝和碳酸钙作吸附剂，把结晶状的胡萝卜素分离成α-和β-两种同分异构体，而且确定了它们的分子式。随后他们分别从植物叶片和蛋黄中分离得到叶黄素，才使色谱法引起科学界的重视。1938年，Kuhn和Lederer从维生素B中分离出B6，因此获得了1938年的诺贝尔化学奖。 Kuhn工作的贡献： ▲ 证明了蛋黄叶黄素是氧化类胡萝卜素 的混合物 ▲ 证实了色谱法可以用来进行制备分离 马丁和辛格提出液液分配色谱 Martin和Synge用水分饱和的硅胶作固定相，以含有乙醇的氯仿作流动相，甲基橙作显色剂（指示氨基酸的位置）分离乙酰基氨基酸[5]混合物：苯丙氨酸、亮氨酸-异-亮氨酸和脯氨酸-缬氨酸-蛋氨酸等三组氨基酸。为此，Martin和Synge获得1952年度的诺贝尔奖。 他们的主要贡献 ☆ 首次提出分离过程的理论/数学处理----塔板理论，这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量地描述、评价分离过程； ☆ 在色谱过程中最早引入分配平衡取代吸附平衡，即采用分配色谱进行分离。此外，将一种液体固定在适当的载体上，使第二种液体流过前者而实现分离，也是一个很重要的成就。☆ 提出了色谱法进一步发展最有远见的预言：一是“流动相可用气体来代替，对分离更有好处”；二是“使用非常细颗粒的填料和柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板” 氨基酸分析仪 1958年美国生物化学家斯坦因（W.H.Stein）和莫尔（Moore）研制出氨基酸分析仪（一种低压高效液相色谱仪），并用它确定了核糖核酸的分子结构。此后，氨基酸分析仪一直成为蛋白质和酶结构的重要工具，为此他们获得了1972年诺贝尔化学奖。 高效液相色谱仪的成功研制 60年代末，由于生命科学发展需要，对一些高极性、大分子量、热不稳定和离子型化合物的分离也促使高效液相色谱的研究。荷瓦斯（Horvath，1967）、哈伯（Huber，1967）、科克兰（Kirkland，1969）三个研究小组分别报道高效液相色谱仪的研制 主要贡献 ☆ 高效填料：细颗粒、耐压；特别是键合固定相研制☆ 高压泵:高精密度流量、高压和耐腐蚀流路通道（克服细填料带来的流速慢的缺点，同时加快了传质过程）☆ 仪器检测：高灵敏度连续检测高效液相色谱的重要特征一是由经典“开放柱液相色谱”向“密闭柱液相色谱”方向发展，实现了分离分析一体化；二是色谱柱的“现代化”，即采用小颗粒高效固定相和高压泵输送流动相，强化了两相的传质，实现了高效快速分离。  HPLC是整个70～90年代分析化学发展最为迅速的一个分支，部分地满足了迅猛发展的生命科学的需要。由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性HPLC应用范围广，适于非挥发性和热不稳定组分的分析对被测物质活性影响小，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。 2．特点 高 效：柱效可达10万理论塔板数 高选择性：高柱效且流动相参入分离 高灵敏度：检测器有较高的灵敏度 快速分析：高压泵的使用加快分析速度 3．方法的局限性 1.HPLC使用多种溶剂作为流动相，当进行分析时所需成本高于GC，且易引起环境污染。梯度洗脱时比GC程序升温操作复杂。 2.HPLC缺少GC使用的高灵敏度的通用检测器（如热导检测器，氢火焰离子化检测器。 3. HPLC不能代替GC去完