蛋白质的量测定Folin酚法课件.pptVIP

目的要求 实验原理 Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸，硫酸，溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。 试剂和器材 一、试剂 Folin—酚试剂: 试剂甲： 1) 4%碳酸钠溶液 2) 0.2mol/L氢氧化钠溶液 3) 1%硫酸铜溶液 4) 2%酒石酸钾钠溶液。 临用前将（1）与（2）等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液。（3）与（4）等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按50:1的比例配合，即成Folin—酚试剂甲。此试剂临用前配制，一天内有效。 试剂和器材 试剂乙： 称钨酸钠（Na2WO2?2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4?2H2O）25g置2000ml磨口回流装置内，加蒸馏水700ml，85%磷酸50ml和浓硫酸100ml。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50ml及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000ml，过滤即成Folin—酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕色瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。 试剂和器材 二、标准蛋白质溶液 1. 标准蛋白质溶液 结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度配制成250ug/ml蛋白溶液 试剂和器材 三、器材 试管及试管架；0.5,1,及5ml移液管，恒温水浴，分光光度计。 操作方法 一、制作标准曲线 取试管，按下表操作： 注意事项 (1) Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin－酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白 质作用生成碱性的铜－蛋白质溶液。当Folin－酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还原反应产生在磷钼酸－磷钨酸试剂被破坏之前。 (2) 血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将血清酌情稀释 重庆师范大学 重庆师范大学 蛋白质的定量测定 ——Folin-酚法 （1）学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理和方法； （2）制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量。 ? ? ? ? ? ? ? 500 迅速摇匀，室温20—25℃水浴保温30min，在500nm*处比色 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Folin-酚乙试剂/ml 摇匀，于20—25℃放置10min 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 Folin-酚甲试剂/ml 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水/ml 1.0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 标准蛋白质溶液/ml 未知样品 6 5 4 3 2 1 试管编号 试剂处理