细胞工程植物胞培养技术第12节.pptVIP

植物的单细胞分离及培养 植物细胞的悬浮培养 植物细胞的规模培养 植物细胞培养的应用 知识目标 掌握植物的单细胞分离方法 掌握植物的单细胞培养方法 植物细胞规模培养技术要点 掌握植物细胞悬浮系的建立以及种细胞的筛选方法。 了解植物细胞悬浮培养生物反应器主要类型及其特点 了解提高细胞次生代谢产物的途径 能力目标 会分离植物单细胞（详见实验实训指导）。 会培养植物单细胞（详见实验实训指导）。 能力目标 会分离植物单细胞（详见实验实训指导）。 会培养植物单细胞（详见实验实训指导）。 一、由植物器官分离单细胞 要从完整植物器官中分离单细胞，通常主要采用机械法和酶解法等。 叶片是分离单细胞的最好材料。 二、由愈伤组织分离单细胞 这是用愈伤组织分离获得游离单细胞的方法。它是将园艺植物的器官或组织采用一般的组织培养方法诱导愈伤组织，把产生的愈伤组织继代培养，然后将继代培养的愈伤组织置于悬浮培养液中。可加少量纤维素酶和果胶酶以促使愈伤组织离散，还可用搅拌．振荡等方法加速其离散。 最后，将这种悬浮液用一定规格的细胞筛去除未分散的愈伤组织和较大的细胞团，这样剩下的游离细胞和较小细胞团的悬浮液即可作为接种液。 主要步骤： 1 诱导产生愈伤组织； 2 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性； 3 将这种悬浮液用一定规格的细胞筛去除未分散的愈伤组织和较大的细胞团，这样剩下的游离细胞和较小细胞团的悬浮液即可作为接种液。 优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。 第二节 单细胞培养技术 本节主要介绍植物单细胞培养的意义、培养方法、影响因素和注意事项。 一、植物单细胞培养的意义 1．建立单细胞无性系； 2．排除体细胞的干扰，有利于对细胞活动跟踪观察； 3．培养用于无性繁殖，大大提高繁殖速度； 4. 用于生物科学研究； 5. 有目的的改造园艺植物种质资源。 二、单细胞培养的方法 单细胞培养的方法有液体浅层培养； 微室培养（微滴培养）； 平板培养； 看护培养； 悬浮培养等。 （一）液体浅层培养 1．概念：液体浅层培养是指先将细胞制成一定密度的细胞悬浮液，用吸管将悬浮液移到培养皿中形成浅层，一般1mm左右，石蜡膜封口，静置培养。 2．液体浅层培养法特点： 优点：培养物与空气接触面大，有利于气体交换，通气性好；细胞代谢产物容易扩散，有利于有毒物质的扩散，不会造成有害物质的危害；继代培养方便．便于观察。 缺点：由于细胞可以游动，不能进行定点观察单细胞生长．分裂后，难以得到单细胞系。 特点： 有利于有毒物质的扩散； 有利于气体交换； 不利于定点观察； 单细胞生长、分裂后，难以得到单细胞系。 （二）微室培养（微滴培养）（40-100μl） 1．概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，即将细胞培养在很少量的培养基中，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。 薄层培养微室制作示意图 （三）平板培养 1．概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养(一般是将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合接种） 2. 主要用途 是为了分离单细胞无性系，研究其生理、生化遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。 广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。 One of the most widely used method for single cell cultrue （3）制平板：细胞悬浮液与融化状态（35 ℃ ）条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板，盖上培养皿盖。用封口膜封严培养皿。 (4) 培养： 26℃置暗处培养21天。低倍显微镜观察， 记数单细胞或小细胞团，计算置板效率（也称植板率）。 细胞的平板培养示意图 植板效率（或植板率）：已形成细胞团的百分数（即每100个铺在平板上的细胞中有多少个能长出细胞团）。 每个平板上形成的细胞团数 植板效率= 该平板上接种的细胞数 5. 平板培养必须注意的方面 （1）选用的培养基，无论是否条件培养基，必须是能够在低的初始植板密度下使细胞生长。 （2）不要选用处在静止期过久的细胞。因为处在分裂旺盛时期的细胞才有最高的植板率。 （3）在固体培养基中适宜的初始植板密度因植物种类而不同。如：烟草细胞适宜的为5~10 ×10 3 个/ml,若低于此数则植板率显著下降。 （4）接种时培养基的温度要控制，一般不超过35 ℃ 。 （四）看护培养 1.概念： 指用一块