中药熏蒸对佐剂型关节炎大鼠血液关节中白细胞介素1β影响.docVIP

中药熏蒸对佐剂型关节炎大鼠血液、关节中白细胞介素-1β的影响 【摘要】 目的 观察中药熏蒸对佐剂性关节炎(AA)模型大鼠血液及关节中白细胞介素-1β(IL-1β)的影响,探讨中药熏蒸疗法抗炎作用机理。方法 将50只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、水熏组、中药低熏组、中药高熏组。除正常组外,其余各组于大鼠右足跖皮下注射弗氏完全佐剂0.1 mL造成AA模型,将水熏组、中药低熏组、中药高熏组进行熏蒸治疗10 d。造模后第21 日,取大鼠血清及关节滑膜,用酶联免疫法(ELISA)检测血液中IL-1β的含量,免疫组化检测关节中IL-1β的表达水平。结果 中药熏蒸对大鼠血液中IL-1β含量较模型组均有显著降低(Plt;0.05),对大鼠关节中IL-1β的强阳性表达与模型组有明显差异(Plt;0.05)。结论 中药熏蒸可以下调AA模型大鼠血液中异常升高的致炎因子IL-1β的水平,抑制关节滑膜中IL-1β的表达。 【关键词】 中药熏蒸疗法；大鼠；佐剂性关节炎；白细胞介素-1β 中药熏蒸疗法操作方便,适用症广,疗效确切,但在熏蒸机理的研究方面刚刚起步。本实验从熏蒸对佐剂型关节炎(AA)大鼠血液、关节中白细胞介素-1β(IL-1β)的影响,探讨该疗法的抗炎作用机理,为该疗法推广应用提供临床和实验依据。 1 实验材料　 .1 动物 健康清洁级雄性Wistar大鼠50只,体重(140±20)g,中国人民解放军广州军区广州总医院实验动物中心提供。 　　1.2 试剂 　　弗氏完全佐剂,美国Sigma公司；IL-1β的酶联免疫(ELISA)检测试剂盒,上海森雄科技实业有限公司,美国RD公司；IL-1β的免疫组化检测试剂盒,武汉博士德公司。 　　1.3 熏蒸药物 羌活20 g,独活20 g,防风15 g,桂枝15 g,细辛10 g,川芎20 g,海风藤30 g,徐长卿30 g,姜黄20 g,苏木20 g,冰片1 g,中国人民解放军广州军区广州总医院中药房提供。熏蒸方中前10味中药由自动煎药机煎煮成53.3%浓度的中药液保存,熏蒸治疗时按高、低浓度分别稀释成6.67%和3.33%浓度的中药液,冰片待熏蒸治疗前加入药液中。 　　1.4 仪器 动物熏蒸笼；三用电子恒温水槽,广东省汕头市医用设备厂产品；低温离心机,美国Beckman公司产品；LEICA-RM2245型组织切片机；Lt2-12550酶标仪,澳大利亚Biocell公司产品；NIKON-E600显微镜；生化培养箱。 　　2 实验方法 　　2.1 佐剂性关节炎模型的建立 50只大鼠随机留取10只作为正常组,其余40只接受弗氏完全佐剂(CFA)造模,即将CFA充分振荡混匀后,在每只造模组大鼠右踝关节下0.5 cm处皮下注射CFA 0.1 mL[1]。注射后1 d,各造模组大鼠注射区局部色红、肿胀、皮温升高,活动欠灵活,第3日右足肿胀达峰值,并于3～5 d开始逐渐消退,至第10日,大鼠右足再度肿胀,并同时出现对侧后肢肿胀,呈进行性加重。多发性关节炎的出现表明大鼠AA模型建立成功。 　　2.2 分组及处理方法 造模后第11日,40只模型大鼠随机分成4组,模型组、水熏组、中药低熏组、中药高熏组各10只。正常组和模型组常规喂养,不做熏蒸处理；水熏组给予(59±1)℃蒸馏水熏蒸,蒸气温度为39～40 ℃；中药低熏组给予相同温度3.33%的中药液熏蒸；中药高熏组给予相同温度6.67%的中药液熏蒸。将大鼠放入动物熏蒸笼,开启电子恒温水槽,待蒸汽温度达到熏蒸要求时,开始熏蒸并计时,每次熏蒸20 min,连续10 d。造模后第21日,予腹腔麻醉后心腔取血,置抗凝管内混匀,后颈椎脱臼法处死。大鼠处死后,取右后肢踝关节及以下足爪,扒去皮毛,剔除肌肉、肌腱等附着组织,剪去足爪,留取完整踝关节,用10%中性甲醛固定48 h,EDTA脱钙15 d,脱水、浸蜡、包埋、切片。 　　2.3 指标检测 　　2.3.1 大鼠血液中IL-1β含量的检测 　　大鼠抗凝血行ELISA法检测血液中IL-1β的含量,测定步骤按检测药盒说明书严格执行。 　　2.3.2 大鼠关节中IL-1β含量的检测 　　大鼠关节切片后脱蜡、水化；PBS洗2次,各5 min；用PBS配置新鲜的3% H2O2,室温封闭8 min,蒸馏水洗3次；抗原修复(pH 6.0的枸橼酸钠缓冲溶液在恒温水浴加热至95 ℃,放入载玻片加热15～20 min)；自然冷却后PBS洗5 min；滴加正常山羊血清封闭液,室温20 min。甩去多余液体；滴加Ⅰ抗,4 ℃保湿过夜；37 ℃复温45 min；PBS洗3次。滴加生物素化Ⅱ抗,室温20 min；PBS洗3次；滴加新配试剂SABC,室温20 min；PBS洗4次；DAB显色3 min(镜下掌握显色程度)；蒸馏水洗；脱水、透明、