中压色谱注意.doc

中压色谱注意： 1 柱压不得超过1Mpa 流速在0.5ml/min，（0.25-0.75ml/min）装柱子时，需要将色谱仪开启，在溶液流出来时装，柱子口需要先充满溶液 再拧螺丝。装好之后，先用50ml的脱气的水在0.5ml/min流速下洗柱子100min (用水交换乙醇)再用50ml的脱气流动相buffer在0.5ml/min流速下交换水100min。 2 管道内不能有空气，换溶液时需要将色谱停止，再换溶液，再开色谱仪 3 色谱柱的口不得乱拆 以防气泡进去 4 superdex200 10/300 GL 规格：体积24ml 左右，直径10*300-310mm， pH最佳范围3-12 清结时的pH范围1-14， 最适温度在＋4－40摄氏度，保存温度在＋4－30摄氏度， 分离的蛋白质分子量在10000－600000 能够分离《＝10mg的蛋白质，样品的体积25－500微升，过滤样品用0.22微米的滤膜或者在10000g离心10min.dextrans(糖类)1000－100000 流速在0.25－0.75ml/min 最大流速在1ml/min 承受的最高压 1.5Mpa/15bar/218psi 做中压色谱的整个过程概述 一 做色谱前期准备工作： 1 将需要分离的样品用0.22微米的膜过滤，若有机溶液溶解的样品，需用有机系滤膜过滤，若水溶液溶解的样品，需用水系滤膜过滤（注：水系滤膜不可过滤有机相溶液，但有机系滤膜可以过滤水相溶液） 2 将冲洗管道的20％乙醇和水及流动相溶液（加一定浓度叠氮化钠）均用0.45微米的滤膜抽滤，既可以达到过滤目的，又可以脱气。切记，凡是水溶液或水，在每日用时都得用抽滤起抽滤脱气。 二 第一次用柱色谱时：注：此时色谱柱和管道均充满20％乙醇。 1 开计算机和色谱主机 等待自检稳定到Template界面 2 系统泵的清洗：把A液管（1号位置）吸头放入脱过气的水中，检查整个管道有无气泡，若有，须将inject valve position放到waste 状态（如果已安上柱子，水不经过柱子，直接从进样阀处的5号waste出来到废液瓶），调大流速到5ml/min ，排掉管道中的空气，如果管道中微小的空气排不掉，需给管道中人为充少量空气，再调大流速到5ml/min，直到空气排除，并使清洗管道的水的体积在20ml左右。即用水交换乙醇 3 装柱子：用水清洗完管道之后，将流速调到0.5ml/min，再将inject valve position选择到load状态，按start run 运行，等待水流出与柱子连接的管之后，开始装柱子，柱子口需要先充满溶液，再拧螺丝，防止空气进入，安装好柱子，之后检查与柱子连接的管道接口有无漏水，确保密封。直到水过柱50ml（2倍柱体积）为止。 4 用水冲洗柱子完毕之后，按pause暂停中压色谱主机，将吸头放入抽滤过的流动相溶液中，开始运行，直到溶液过柱50ml（2倍柱体积）为止。即用buffer换水。 5 样品环的清洗：在洗柱子过程中，可用注射器吸取多于上样环体积的脱气的水洗上样环，再用流动相溶液洗上样环。 6 层析柱的平衡和样品的分离：将流动相溶液过柱，流速设定为0.5ml/min,设定压力报警的值为1Mpa,运行一段时间，按start run 看电脑上的primeview软件上显示的基线是否平稳， 7 若基线平稳，证明柱子平衡完毕。开始用注射器吸取多于上样环体积的样品注入到上样环中，切记排除注射器中的空气之后，方可上样。将试管摆在收集器中，（切记，收集器归位时，必须手动，搬开收集器旁边的按钮，再归位，再放开按钮使按钮的槽与收集器互卡住），调零，设定收集体积和压力报警，再把inject valve position放到inject状态，使样品全部进入柱子，再将inject valve position放到load状态。待峰洗出基线回到零之后，按end停止运行，此时，软件结果自动保存到primeview evaluation中。注意：primeview evaluation只可以保存10个文件，所以文件必须及时另存到电脑的其它盘中。删掉primeview evaluation中的文件，以备再存入其他文件。 8 系统泵和上样环及层析柱的清洗： 8.1如果次日还需要用色谱仪，则只需将系统泵和上样环用水冲洗干净，系统泵清洗：inject valve position调到waste状态，流速设置5ml/min，待水冲洗管道20ml之后，停止。上样环清洗：用注射器吸取多于上样环体积的水，打入上样环，注射器留再上样口，防止上样口与空气接触，使管道中的溶液蒸发，从而会破坏柱子。 8.2 如果色谱仪两天以上不用，先要用水冲洗系统泵和上样环，方法如8.1，再将流速调至0.5ml/min ，inje