白芷提取物对葛根 黄芩 川芎中活性成分生物药剂学性质—膜透过性的影响及机理分析-effect of angelica dahurica extract on the biopharmaceutical properties of active ingredients in kudzuvine root, baikal skullcap root and ligusticum wallichii - membrane permeability.docx

中文摘要药物透过肠道的膜通透性质是影响药物口服后经胃肠道吸收的主要因素，中 药配伍后可能改变药物活性成分的膜通透性。本文旨在研究葛根中葛根素、黄芩 中黄芩苷、川芎中阿魏酸的肠道转运特性、白芷提取物对其转运制性的影响以及 影响机理。阐明各成分本身的小肠吸收机理；明确白芷提取物对三种成分肠吸收 的作用特点，总结其作用规律；从分子生物角度阐明白芷提取物改变三种成分肠 通透性的作用机理。考察白芷提取物的细胞毒性及肠黏膜毒性，评价其用作肠道 转运吸收促进剂的可行性，为开发新型辅料—吸收促进剂奠定基础。目的： 1.研究白芷提取物对葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸肠道转运的影 响，从生物药剂学的角度阐明白芷与它药配伍使用的原理。 2.研究葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸小肠吸收机制，结合白芷提 取物对其肠吸收的影响，探讨白芷对配伍药物中活性成分肠道转运的影响规律。 3.研究白芷提取物对细胞间紧密连接蛋白、外排蛋白（P-gp）、细胞膜流动性等 肠道转运屏障的影响，从细胞、蛋白分子等水平上探讨白芷提取物对肠吸收转运 阻力的易化作用，从分子机理水平阐明白芷改变配伍药物活性成分膜通透性的作 用机理。 4.研究白芷提取物的毒性，探索白芷活性成分用作肠道转运吸收促进剂的可行 性，为开发新型辅料—吸收促进剂奠定基础。方法：1.检索近年来国内外有关―白芷‖、 ―配伍规律‖、―葛根‖、―黄芩‖、―川芎‖、―生 物药剂学‖、―肠道转运‖等文献，分析综述中药复方配伍规律、中药配伍对药物 肠道转运等生物药剂学性质的影响。2.建立白芷提取物中欧前胡索、异欧前胡索、总香豆素等含量测定方法；采用 大孔树脂分离纯化技术制备白芷提取物；采用水蒸气蒸馏法制备白芷挥发油。 3.外翻肠囊法、Caco-2 细胞模型及大鼠在体单向灌流法研究白芷提取物对葛根 中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸肠道转运的变化；分别计算配伍前后 葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸表观渗透系数（Papp），分析白芷 两个活性组份对各相配药物中有效成分肠吸收的协同效应。4.采用 Caco-2 细胞模型及大鼠在体单向灌流法分别研究葛根中葛根、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸的肠吸收机制；并分别以肠微粒体、细胞间紧密连接调节 剂（EDTA）、外排蛋白抑制剂为工具，探讨各种肠吸收屏障分别在葛根素、黄 芩苷、阿魏酸肠道转运过程中的参与度。5.运用 Caco-2 细胞模型，采用高效液相、荧光探针标记、蛋白印迹（Western Blot）、 流式细胞等技术和手段，分别研究白芷提取物对 Caco-2 细胞紧密连接蛋白（ZO-1）、细胞骨架蛋白（Actin）、P-gp 外排蛋白功能及表达的影响，以及对 Caco-2 细胞膜流动性的影响。分析白芷活性成分影响葛根中葛根素、黄芩中黄 芩苷、川芎中阿魏酸生物药剂学性质的机理。6.通过病理切片、MTT 法以及 Caco-2 细胞电阻可逆性测定，研究白芷活性组分对细胞形态学、组织化学等的影响，探讨白芷活性组分的毒性及其可逆性。结果1.通过三种方法佐证，得出白芷活性成分能显著促进葛根中葛根素、黄芩中黄 芩苷的肠吸收作用（p＜0.05），而葛根素和黄芩苷均为难吸收药物，白芷活性 成分可能对配伍对药中难吸收成分具有促吸收作用。但白芷活性成分对穿川芎 中阿魏酸的肠吸收影响不明显。2.分别研究了葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸肠吸收特性，明确 了葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷及川芎中阿魏酸三个有效成分肠吸收机理。得 出（1）葛根中葛根素的吸收机制以被动转运为主，同时存在着主动转运，P-gp 和 MRP 蛋白可能为其主要载体并参与载体转运的过程。（2）黄芩中黄芩苷的 吸收机制以被动转运为主，同时存在着主动转运，其转运可能不受 P-gp 蛋白 的影响，MRP 蛋白可能为其主要载体并参与载体转运的过程。（3）川芎中阿魏 酸的转运过程存在主动载体转运，加入紧密连接调节剂 EDTA 后，川芎中阿魏 酸肠道转运稍有增加，但作用不显著，印证了其肠道转运以主动转运为主， P-gp 和 MRP 蛋白可能为其主要载体并参与转运的过程，有关其吸收机理有待 进一步的研究。分别研究了葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸在肠微粒体中代 谢情况，分别筛选了肠微粒体系中葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏 酸浓度；进一步研究了白芷配伍各药后，葛根素、黄芩苷、阿魏酸在肠微粒体 中代谢情况，得出了白芷各活性成分对肠微粒体中各代谢酶无影响的结论。3.采用 Caco-2 细胞模型，采用蛋白印迹技术开展了白芷活性成分对细胞间紧密连接蛋白 ZO-1 及骨架蛋白 Actin 的影响研究；采用流式细胞技术研究了白芷活 性成分对 P-gp 蛋白表达的影响；采用荧光探针标记法研究了白芷活性成分对细 胞膜流动性的影响。