第二讲_蛋白质合成、分离.ppt

意义 解析蛋白质结构与功能的关系，为人工合成蛋白质及肽应用提供全面信息； 许多肽具有独特的生物学活性，是生物技术制药的主要目标物； 是目前合成肽的主要方法， 先将不参与形成肽键的活泼基团保护起来。例如，羧基可用活性酯法（酰氯），氨基可以采用碳二亚胺法形成卞氧甲酰胺，合成后再将保护基水解下来。最后分离产物。 80年代，开发出固相合成技术。 在聚苯乙烯树脂小珠固相上合成肽链。 ⑴第一个氨基酸的羧基先和氯甲基聚苯乙烯树脂反应，共价地挂接在树脂上;⑵除去该氨基酸的N-端保护基; ⑶第二个氨基酸（氨基被保护）以碳二亚胺为缩合剂，接到第一个氨基酸的氨基上；⑷除去第二个氨基酸的氨基保护基； 重复上述步骤，使肽链按控制顺序从C端向N端延长。 合成一个十肽，花费27小时，产率85%。 第二类 氨基酸自聚合 实际上是氨基酸成肽反应，已经讲过。从理论上讲，该反应可以用来制备聚氨基酸，但是该反应没有选择性。 第三类 酶合成 在水环境下，合成肽需要消耗能量（ATP）；在非水条件下，蛋白酶等水解酶可转变成合成酶，将氨基酸合成肽。而且不需要消耗ATP。该法优点是条件温和，步骤少，缺点是氨基酸或肽的溶剂体系以及合成物的卸载。 酶催化的反应 水解酶 非水介质中的酶学性质 非水介质中酶保持结构完整性。其活性部位的结构与在水溶液中相同； 非水介质中，酶分子内的氢键起主要作用，〝刚性增加〞，维持其活性中心的构象与在水介质中一致 微量水的影响 影响非水介质中酶活力及选择性的控制步骤 水的作用：调控酶构象 微量水对酶发挥有效催化是必需的，水分子直接或间接参与酶稳定构象的各种非共价作用，弱化荷电基团或极性基团间的相互作用，增加酶柔性、活性增加及选择性 非水介质中酶结合水及结合量 离子化基团水化：与酶分子表面的荷电基团结合；结合量0-0.07g/g酶 极性水族生长：与酶分子表面极性基团结合；结合量0.07-0.25g/g酶 弱吸附：与酶表面弱极性区域结合；结合量0.25-0.38g/g酶 完全水化：酶蛋白表面完全水化；结合量0.38g/g酶 非水介质中酶催化反应类型及应用 酶催化反应的类型 C-O键的形成，包括酯合成、环氧化、糖苷合成、加氧氧化 C-N键的反应，包括肽的合成 C-C键的形成，包括羟醛、酮醛和羟醛转移、醛缩合、醛加成等 还原反应 氧化反应，包括C-H、C=C氧化，醇氧化，酚氧化，羧酸氧化，C-N氧化，异构化反应 形成C-X的反应 （卤化反应） 包括烯烃、炔烃、芳香族及含有活泼的C-H键的化合物的卤化。 酶非水催化反应的应用 ⑴制备光学活性化合物 ⑵合成旋光性高分子 ⑶糖和类固醇的选择性催化 ⑷功能性高分子合成 ⑸可生物降解高分子的酶促合成 合成肌肽及其类似物 存在于动物肌肉中的肌肽是由β-丙氨酸与L-组氨酸组成的二肽，具有抗氧化、清除自由基，pH缓冲等生理功能。其最显著的性质是抗氧化，主要表现为捕获活性氧和自由基，螯合金属离子，结合脂肪酸氧化产物-醛，是迄今发现的最有效天然抗氧化、抗衰老二肽。 肌肽及其类似物的结构式 正丁醇中合成肌肽40℃、pH6.5，转化率84.26% 四氢呋喃中合成肌肽类似物50℃、pH8.5，转化率 76.35% 合成硬脂酰三乙醇铵单酯 硬脂酰三乙醇胺盐酸盐是一种季铵化合物，在日化行业主要用于洗发香波，中和头发蛋白质的负电荷及抗菌。 在头发上的附着力强，产生〝飘逸〞效果，但无光亮。 该物质目前采用酸催化剂在140℃左右脱水合成 用脂肪酶在正己烷中合成，合成温度55℃，转化率72.75%，酶可以反复使用多次。 合成羟基脯氨酸双酯 羟基脯氨酸（L-Hyp ），修饰氨基酸，抗自由基、抗衰老，日化行业在功能性皮肤化妆品中使用。 增味剂；营养强化剂；香味料。主要用于果汁、清凉饮料等。 脂/水平衡系数低，不能透过皮肤细胞膜。 目前采用两步法化学合成。单酯合成温度达120℃，苯系物为带水剂，双酯的合成方法未见公开报道。由于其吡咯环的干扰，预计合成温度将超过160 ℃，伴随单酯键部分水解。 合成羟基脯氨酸双酯无溶剂、脂肪酶、60℃、6-8h，转化率超过93% 酯交换合成单酯 单酯酯化合成双酯 第二节 蛋白质分子量测定⒈最小分子量 如血红蛋白含0.335%铁，其最低分子量=16700 ⒉渗透压法 π=RT（c/Mτ + Kc2）, Mτ=RT/lim ( c 0) π/C 第三节 蛋白质的盐溶与盐析 盐溶：中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著影响，低浓度时，可以增加蛋白质的溶解度，称盐溶。 盐溶是蛋白质吸附盐离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水之间的作用加强，溶解度增高。 溶液离子强度的计算：将各离子的浓度分别乘以其净电荷的平方，然后将所有乘积相加并除以2。 例如，2m