哺乳动物细胞展示型人源scfv抗体库构建及靶向erbb3 scfv筛选-construction of mammalian cell display human scfv antibody library and screening of targeted erbb 3 scfv.docxVIP

安徽医科大学硕士学位论文1 材料与方法 522 结果 583 讨论 654 小结 67全文总结 68参考文献 70附录 76本人简历 76致谢 78综述 812英文缩略词表英文缩写ADC英文全名antibody-durg-conjudge中文全名抗体-药物偶联物Ampampicillin氨苄青霉素Bpbase pair碱基对BSAbovine serum albumin牛血清白蛋白DAPI4,6-diamidino-2-phenylindole二脒基苯基吲哚DMEMdulbecco modified eagle medium Dulbecco改进 eagle 培养基DMSOdimethyl solfoxide二甲亚砜DTTdithiothreitol二硫苏糖醇E.ColiEscherichia coli大肠杆菌EDTAethylene diamine tetraacetic acid乙二胺四乙酸ECDextracellular domain胞外区FACSfluorescence activated cell sorting流式细胞分选术FITCfluorescein isothiocyanate异硫氰酸荧光素FDAFood and Drug Administration食品及药物管理局Fabantigen binding fragments抗体结合片段IPTGisopropy-β-D-thiogalactoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷RLDextracellular ligand-binding domain胞外配体结合区LBLuria-Bertani medium LB培养基mRNAmessenger RNA信使 RNAPAGEpolyacrylamide gel eletrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSphosphate buffered solution磷酸盐缓冲液PCRpolymerase chain reaction聚合酶链式反应PIpropidiom iodide碘化丙啶SDSsodium dodecyl sulfate十二烷基磺酸钠ScFvsingle chain variable fragment单链抗体siRNAsmall interfering RNA小干扰 RNAVHvariable domain of heavy chain重链可变区VLvariable domain of light chain轻链可变区哺乳动物细胞展示型人源 ScFv 抗体库构建及靶向 ErbB3 抗体筛选摘 要抗体药物是目前研究和应用最为广泛的一类生物技术药物，是肿瘤、感染、 炎症等疾病的重要治疗手段。全人源抗体药物因其免疫原性低，在迄今美国食品 药品监督管理局（American Food and Drug Administration, FDA）批准上市的抗体 类药物中（仅指含抗体可变区的抗体药物）占有很大的比重，已成为未来临床应 用抗体发展的趋势。目前，全人源抗体候选序列主要通过噬菌体展示文库筛选获 得，再改构到哺乳动物细胞中进行大量生产表达，这使“万里挑一”获得的抗体在从 原核到真核的过程中面临很大的亲和力改变等风险。相比之下，基于哺乳动物细 胞抗体库筛选出的候选抗体将原核表达系统筛选抗体具备的风险和弊端大大降 低。目前，哺乳动物细胞抗体库技术报道有限，在国内外仍处于起步阶段，具有 很大的学术意义和应用价值。本研究拟构建真核哺乳动物细胞展示型单链抗体（single—chain antibody fragment，ScFv）库，并选取表皮生长因子受体-3（v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3，ErbB3）为靶点进行 ScFv 抗 体筛选以验证本抗体库的有效性。第一部分 构建真核哺乳动物细胞展示型 ScFv 抗体库。 本研究首先收集包括多种病种及健康志愿者在内共 120 例志愿者外周血淋巴细胞，通过提取总核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）并反转录获得互补脱氧核 糖核苷酸（complementary Deoxyribonucleic acid，cDNA），作为扩增人抗体库可变 区基因的模板。参照文献设计 28 对简并引物扩增重链可变区，设计 16 对简并引 物扩增轻链可变区。利用上述引物通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）扩增、胶回收分别获得重链抗体可变区（Heavy-chain variable region, VH） 和轻链抗体可变区（Light-chain variable region,VL）库。通过重叠 PCR，以(G4S)3 的 linker 将