白血病抗血管新生治疗的体内体外实验分析-in vitro and in vivo experimental analysis of anti-angiogenesis therapy for leukemia.docxVIP

中 中 文 摘 要 PAGE PAGE 10 白血病抗血管新生治疗的体内体外实验研究 摘要 目的： 血管生成素是近年新发现的促血管新生因子，对血管管状结构的形成 及血管内皮细胞的存活具有重要意义。已有研究显示在 AML 患者骨髓和 外周血中检测到血管生成素的表达，并在 AML 细胞株 K-562 细胞中发现 血管生成素表达。本实验检测 t(8;21) AML 细胞株 Kasumi-1 细胞及其裸 鼠移植瘤是否表达血管生成素，并应用 HDAC 抑制剂丙戊酸钠（VPA） 处理，观察 VPA 对 AML 血管新生的影响，及对血管生成素（angiopoietin） 表达是否有作用。 方法： Kasumi-1 细胞培养，用不同浓度 VPA 处理 3d，采用 RT-PCR 及 Western Blot 的方法分析细胞血管生成素 1（Ang1）、血管生成素 2（Ang2） mRNA 及蛋白表达水平的变化。建立 Kasumi-1 细胞裸鼠移植瘤模型，分为对照 组和 VPA 治疗组进行实验，用免疫组化方法检测瘤组织 CD34 表达，用 RT-PCR、Western Blot 及免疫组化的方法分析瘤组织 Ang1、Ang2 及 VEGF mRNA 及蛋白表达水平的改变。 结果： 1 VPA 抑制 Kasumi-l 细胞及其裸鼠移植瘤的生长 1.1 VPA 对 Kasumi-l 细胞的抑制作用 不同浓度 VPA 处理 Kasumi-1 细胞 3d 后，观测到 Kasumi-1 细胞的生 长明显受抑，并且这种抑制作用呈剂量依赖性。VPA 处理 Kasumi-1 细胞 3d 时的半数抑制浓度（IC50）为 2.46mmol/L。 1.2 VPA 对裸鼠移植瘤生长的抑制作用 VPA 体内用药明显抑制裸鼠 Kasumi-1 细胞移植瘤的生长，观测到随 着用药时间延长，VPA 用药组移植瘤生长速度相比对照组明显减慢，用 药 2 周后处死小鼠，实验过程中没有裸鼠死亡， VPA 组瘤体积及重量与 对照组相比明显减少，具有统计学差异（P0.05），计算肿瘤抑制率(IR%) 为 57.25%。 2 VPA 对 Kasumi-1 细胞裸鼠移植瘤微血管密度（MVD）的影响 经免疫组化法检测移植瘤血管内皮细胞 CD34 表达的变化，VPA 组 2.600±0.200，与对照组 8.470±0.300 相比明显减少，差异有统计学意 义，P＜0.01。 3 VPA 对 Kasumi-1 细胞及移植瘤 Ang1 表达的影响 VPA 对 Kasumi-1 细胞 Ang1 mRNA 及蛋白表达的影响 VPA 对 Kasumi-1 细胞 Ang1 mRNA 表达的影响 经半定量 RT-PCR 的方法分析，VPA 下调 Kasumi-1 细胞 Ang1 mRNA 表达，并且这种作用呈剂量依赖性。1-3mM VPA 处理 3d 时与空白对照 组相比，Ang1 mRNA 表达明显减少，具有统计学意义（P0.01）。 VPA 对 Kasumi-1 细胞 Ang1 蛋白表达的影响 经 Western Blot 检测 Ang1 蛋白发现，不同浓度 VPA 处理细胞 3d， 随着用药浓度的增加，Ang1 蛋白表达量减少，1-3mM VPA 处理 3d 时与 空白对照组相比，Ang1 蛋白表达明显减少，具有统计学意义（P0.01）。 3.2 VPA 对移植瘤 Ang1 mRNA 及蛋白表达的影响 3.2.1 VPA 对移植瘤 Ang1 mRNA 表达的影响 经半定量 RT-PCR 的方法分析，VPA 明显减少移植瘤 Ang1 mRNA 表 达，VPA 组 0.117±0.010，对照组 0.430±0.062，两组具有统计学差异 （P0.01）。 3.2.2 VPA 对移植瘤 Ang1 蛋白表达的影响 经 Western Blot 方法检测发现，VPA 明显减少移植瘤 Ang1 蛋白表达， VPA 组 0.137±0.018，对照组 0.325±0.020，两组具有统计学差异 （P 0.01）。 经免疫组化法检测瘤组织中 Ang1 表达发现，VPA 组相对对照组， Ang1 表达明显减少。 4 VPA 对 Kasumi-1 细胞及移植瘤 Ang2 表达的影响 VPA 对 Kasumi-1 细胞 Ang2 mRNA 及蛋白表达的影响 VPA 对 Kasumi-1 细胞 Ang2 mRNA 表达的影响 经半定量 RT-PCR 的方法分析，VPA 下调 Kasumi-1 细胞 Ang2 mRNA 表达，呈剂量依赖性。1-3mM VPA 处理 3d 时与空白对照组相比，Ang2 mRNA 表达明显减少，具有统计学意义（P 0.01）。 VPA 对 Kasumi-1 细胞 Ang2 蛋白表达的影响