第九章 基因治疗(二).pptVIP

（四）单纯性疱疹病毒载体 单纯性疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）基因组为152kb的双链DNA，有3个 复制起始点，3个包装信号位点。 特点： 1.缺失多个基因 仍能复制； 2.只要有包装信号，外源DNA就可 被包装入病毒颗粒。 1型单纯疱疹病毒（HSV-1）属于人嗜神经病毒，可在神经元细胞内建立潜伏感染。基于此原因，研究人员希望把HSV-1改造成为可定向导入神经系统的载体。 HSV-1可被改造成两类载体：一是扩增子载体（amplicon）。即仅把HSV的复制起点和包装信号序列插入到细菌质粒中。 当其转染至包装细胞，用HSV辅助病毒超感染，便可获得含有扩增子的假病毒。 另一类为重组1型单纯疱疹病毒。即删除了与复制相关及非必需基因，以减少细胞毒性，可用于宿主神经元细胞中长期表达外源治疗基因。但如果宿主神经元已经潜伏了野生型单纯疱疹病毒，这就很可能重新激活病毒而进入裂解期。 基于此哈佛大学的姚丰博士利用病毒自身的“反式显性失活”（trans-dominant negative）而构建了一个既可抑制自身病毒复制，又可抑制野生型病毒复制的重组病毒。 此病毒可以作为新型、安全性单纯疱疹病毒载体，用于临床实验的研究。HSV载体不仅感染神经元细胞，亦可感染非神经元细胞如上皮细胞，目前HSV载体已用于恶性间皮瘤、帕金森症等疾病的治疗研究中。  HSV作为基因治疗载体有以下特点： （1）基因组序列已十分清楚； （2）可容30kb外源DNA； （3）宿主范围广，可感染脊椎动物的各种细 胞。 （4）体外培养易得到较高的滴度； （5）具嗜神经性，可用于神经系统得基因 治疗。如帕金森氏症，老年性痴呆。 HSV载体需改进的地方 （1） HSV的一些组分对宿主细胞有毒害； （2）外源基因表达水平低； （3）外源启动子在HSV载体中的活性取 决于启动子的调节元件及在HSV 基 因组中的位置。但目前HSV载体是 唯一可将外源基因和启动子导入神 经系统的成功载体。 （五）重组痘苗病毒载体 痘苗病毒（vaccinia virus,VV）,长为187kb的双链DNA病毒，其基因组中有大量非必须区，可被外源DNA所取代，从而构建重组痘苗病毒。 因VV基因组庞大，酶切位点多，故外源基因不能直接插入，而必须采用同源重组的方法。 程序是： （1）构建带有VV序列的质粒； （2）在VV启动子下插入外源基因； （3）转染已感染野生型VV的细胞，使其重组； （4）筛选。 （六）染色体外的自主复制载体 人类人工染色体(Human artificial chromosome, HAC) HAC的主要成分和YAC相同。它们由人类的端粒 DNA，基因组DNA和重复的α-卫星DNA（具有着 丝粒的功能）混合而制成。将这些未连接的混合物 加到脂质体中，再加到培养细胞中。可以发现有些 细胞含有小的新的染色体，似乎是细胞中含有了附 加成分。 当此技术完善时HAC将成为转移大量人类DNA进入 细胞并稳定复制的理想载体。 第三节 基因治疗药物： ① 基因药物：如反义RNA、核酶、RB、肽核酸、 三链DNA、野生型基因、抑癌基因（如p53、 RB）、自杀基因、耐药基因、siRNA、小片 段同源序列和激活小RNA等； ② 小分子药物如一些阻碍病毒复制相关蛋白酶的 抑制剂； ③ 多肽和蛋白质药物，如α-干扰素和ω-干扰素 等细胞因子类蛋白质药物； ④ 基因工程抗体药物，如单抗等。 一、p53基因 抑癌基因p53是目前研究较多的基因药物， 主要是p53重组腺病毒（Ad-p53）。 美国自1995年以来即开始了p53重组腺病毒 制品的临床试验。 2003年我国国家食品药品监督管理局批准 重组人p53腺病毒注射液新药证书，宣告了 世界上第一个癌症基因治疗药物在中国诞生。 二、siRNA 质粒载体介导的细胞内表达siRNA法 通常通过带有RNA pol Ⅲ启动子的siRNA表达 质粒载体，将长度为21nt的针对特定基因的双 链siRNA或者长度为45～50nt的小分子发夹 RNA (small hairpinRNA ,shRNA)转染到细胞 中，shRNA在细胞内会自动被加工成siRNA， 从而引发“沉默”或表达抑制。 构建腺病毒载体系统