5―脂氧合酶抑制剂治疗Jurkat细胞移植瘤裸鼠实验研究.docVIP

5―脂氧合酶抑制剂治疗Jurkat细胞移植瘤裸鼠实验研究 　　【摘 要】目的：观察5-脂氧合酶抑制剂NDGA（去甲二氢愈创木酸）对急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞系Jurkat细胞在裸鼠体内生长的影响。方法：选用Jurkat细胞裸鼠体内接种成瘤后，腹腔注射给药观察其对肿瘤生长的影响。Western检测细胞细胞周期蛋白p-ERK，Bcl-2/Bax的变化。结果：NDGA能抑制肿瘤的生长（P　　【关健词】急性淋巴细胞白血病；裸鼠；凋亡；p-ERK；Bcl-2；Bax 　　【中图分类号】R-33 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）01-0042-02 　　急性淋巴细胞白血病（ALL）是一种较为常见的血液系统疾病之一。ALL约占占儿童白血病的75%，且近年来白血病的发病率呈逐年上升趋势，每年新增病例约9000人（儿童和成人）[1]。因此，寻找行之有效的化疗药物具有十分重大的意义。去甲二氢愈创木酸 （NDGA）是常青黎科灌木Larrea tridentate中提取的一种抑制白三烯等代谢产物生成的脂氧合酶抑制剂，近年来国内外研究表明其对部分肿瘤也有抑制作用[2]，但尚未见其对人白血病细胞系作用的报道。本文旨在研究NDGA对人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞裸鼠移植瘤生长的影响来探讨其抗肿瘤活性的机制，为其临床应用提供参考依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞株购自南京凯基生物有限公司。RPMI 1640培养基购自杭州吉诺生物医药技术有限公司。小牛血清购自杭州四季青公司。裸鼠购自中国医学科学院实验动物研究所，在SPF级动物合格环境下饲养。NDGA 购自Calbiochem公司。β-actin，p-ERK，Bcl-2和Bax抗体均购自Santa Cruz。辣根过氧化酶标记物山羊抗小鼠IgG（二抗）和碱性磷酸酶显色试剂盒购于北京中山生物技术有限公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1细胞培养和药物处理 　　Jurkat细胞接种于含10%胎牛血清体积分数的RPMI 1640培养液 （pH值7.2-7.4，含100 u/ml青霉素和100 u/ml链霉素）。于37℃，5%CO2，饱和湿度的恒温培养箱中传代培养，取对数生长期细胞用于实验。 　　1.2.2 裸鼠实验模型的建立及处理 　　所有实验裸鼠接种肿瘤前给予400cGy137Cs γ射线全身照射。取对数生长期的Jurkat细胞，用不含血清的RPMI 1640基础培养液洗涤细胞2次，重悬于RPMI 1640培养基，细胞浓度为5×107细胞/mL。充分混匀后取200 μ1细胞混悬，皮下接种于裸鼠的右背侧。游标卡尺测量肿瘤大小，接种Jurkat细胞10天后挑选成瘤小鼠做为第（3）步实验对象，随机分三组，每组5只小鼠：A组（对照组）、B组（生理盐水组）、C组（NDGA组），NDGA组腹腔给予NDGA（10μM，0.1ml/10g，1/5d）处理，生理盐水组组腹腔给予同等量生理盐水。肿瘤体积的计算公式为π/6（Wl×W2×W 2），其中W1代表长径，W2代表短径。实验结束后拉颈处死小鼠后，迅速分离瘤组织，分为2部分：一部分放进0.1 %DEPC处理的细胞冻存管中，立即放进液氮，备提蛋白；另一部分用10%中性甲醛固定24h，常规石蜡包埋，切片，作TUNEL检测。 　　1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡细胞 　　各组小鼠肿瘤细胞凋亡率的检测依照TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒说明步骤进行。结果的判定以细胞核着棕黄色者为阳性细胞。每个标本观察一张切片，随机选取5个高倍视野计数100个细胞。凋亡细胞阳性指数（AI）的计算按以下公式进行，AI=（凋亡阳性细胞数/总计细胞数）×100%。 　　1.2.4 Western蛋白印迹法检测NDGA对Jurkat细胞p-ERK，Bcl-2/Bax蛋白表达的影响 　　取对各组小鼠肿瘤组织提取细胞总蛋白。总蛋白浓度经Bio-Rad测定，SDS凝胶电泳分离后转移至PVDF膜上。加稀释一抗抗体（靶蛋白抗体）静置过夜，TBST漂洗，加入二抗孵育，荧光显色，冲洗。扫描蛋白印迹胶片后观察结果，按照靶蛋白/β-actin蛋白比例用Scion图像分析系统（4.02版本）分析条带影像。 　　1.3统计学分析 　　数据应用SAS 6.12和SPSS 13.0统计软件进行处理， 肿瘤生长情况采用两因素方差分析，western结果采用单因素方差分析。检验水准为α=0.05。 　　2 结果 　　2.1 NDGA对Jurkat细胞移植瘤生长的影响 　　结果显示NDGA对Jurkat细胞移植瘤生长具有显著抑制作用，与对照组和生理盐水组相比，实验组肿瘤生长明显变慢，不同组间肿瘤体积有显著性差异（F=23.975，P 　　3 讨论