降钙素原胶体金免疫层析快速诊断试纸条研制和评估.docVIP

降钙素原胶体金免疫层析快速诊断试纸条研制和评估 　　摘要：目的：建立一种快速检测降钙素原的胶体金免疫层析试纸条，并优化制备中各关键步骤的实验条件。 　　方法：以柠檬酸三钠还原法制备25nm的胶体金溶液，制备免疫胶体金复合物，组装胶体金免疫层析快速诊断试纸条。 　　结果：用柠檬酸还原法制备的25nm胶体金溶液呈亮红色。胶体金标记降钙素原单克隆抗体的最低稳定浓度10μg/ml，最适稳定量为12μg/ml。降钙素原单克隆抗体标记的最适pH为7.0。应用定量检测试剂（胶体金法）和半定量检测试剂（免疫色谱检测法）对160例临床标本进行检测，通过比较阳性一致性、阴性一致性、总一致性，计算Kappa值，判断检测结果的一致性。 　　结论：通过对160例临床标本检测结果进行比较，阳性一致性为96.6%，阴性一致性为97.2%，总一致性为96.9%，Kappa值为0.937。胶体金免疫层析试纸条质量稳定性不但与抗原抗体的选择、用量优化、层析材料的选择、胶体金的制备与标记等因素密切相关，而且缓冲系统的优化、辅助添加剂的选择与优化组合也非常重要。 　　关键词：降钙素原 胶体金 免疫层析检测 　　【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2013）10-0021-02 　　降钙素原（Procalcitonin，PCT）是降钙素的前体激素，正常情况下由甲状腺C细胞分泌，经细胞内蛋白水解酶水解后形成的活性成分许多学者研究发现，严重全身性细菌真菌和寄生虫感染时，PCT异位生成，水平异常升高，且升高的程度与感染严重度及预后相关许多临床研究证明，PCT在不同医学领域对诊断和指导治疗有很高的价值，与目前所应用的诊断指标相比，PCT在鉴别诊断和控制感染及严重炎症方面提供了额外的信息随着临床实践性研究的不断深入，临床数据的不断积累，PCT作为一个全身性细菌感染和脓毒症辅助和鉴别诊断的常规指标将成为共识，并将得到广泛的应用[1]。 　　胶体金免疫层析试纸条法因其快速、简便，不需要大型装备，可以实现现场快速检测等特点，已成为目前传染病快速检测的研究热点。本研究利用双抗体夹心法制备了检测降钙素原的胶体金免疫层析试纸条，将检测结果与德国B.R.A.H.M.S GmbH公司商品化的降钙素原测定试剂盒比较，对试纸条特异性进行评价。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料。氯金酸（HAuCl4?H2O），上海化学试剂公司产品；柠檬酸三钠（Na3C6H5O7?2H2O），北京北化精细化学品有限公司产品；牛血清白蛋白（BSA），均为Sigma公司产品；聚乙二醇（PEG 20000），FLUKA公司产品；以上试剂均为分析纯。 　　1.2 方法。 　　1.2.1 玻璃器皿的清洁。制备胶体金的所用容器均应反复清洗，并硅化处理玻璃容器的内表面，最后用超纯水冲洗晾干备用。 　　1.2.2 胶体金颗粒的制备。采用柠檬酸三钠还原法，制备25nm的胶体金。具体操作方法如下：取100mL双蒸水，加热至沸腾加入1mL 1%的氯金酸，搅拌下准确加入1.5mL体积分数为1%的新鲜制备的柠檬酸三钠水溶液。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸三钠加入后很快变成灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色，20min后停止加热。冷却至室温后4℃避光保存。 　　1.2.3 胶体金溶液的最佳PH值确定。取1mL的胶体金溶液8份，分别用0.2mol/L K2CO3将pH值调至5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0；分别加入0.2μg/mL降钙素原单克隆抗体100μL，混匀，静置10min后，加入100μL质量分数为10%为NaCl溶液，静置0.5h后观察胶体金颜色。胶体金颜色没有发生改变的最低pH值为胶体金溶液的最佳pH值。 　　1.2.4 确定最低蛋白稳定量。在标记前，应首先测定能稳定一定量胶体金所需要的最小蛋白用量。将胶体金溶液调至最佳PH值，抗原经高速离心除去大的聚集物，用5mmol/L PH8.0的PB溶液稀释至0.2mg/ml，将待标记降钙素原单克隆抗体逐级稀释后，各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中，混匀；5min后，在上述各管内分别加入10%氯化钠溶液0.1ml，混匀，室温静置，用分光光度计OD580测定。 　　未加蛋白及加入蛋白量不足以稳定胶体金的试管，即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则保持胶体金的红色不变。以此使胶体金红色不变而蛋白质含量最低的试管的蛋白量，即为稳定1ml胶体金的必需蛋白量，也即最低稳定量。在此基础上再加20%即为稳定1ml胶体金所需蛋白质的实际最适用量。 　　1.2.5 胶体金标记抗PCT单克隆抗体。 　　1.2.6 胶体金标记降钙素原单克隆抗体。将胶体金调至最适PH值，加入最低蛋白稳定量的