水芹总酚酸对人类免疫缺陷病毒逆转录酶抑制作用.docVIP

水芹总酚酸对人类免疫缺陷病毒逆转录酶抑制作用 　　[摘要] 目的 探讨水芹总酚酸对人类免疫缺陷病毒（HIV）逆转录酶的影响作用。 方法 将水芹总酚酸和阳性对照药奈韦拉平用磷酸盐缓冲液（PBS）和二甲基亚砜（DMSO）分别配制成10、1、0.1 mg/L和50（13.32 mg/L）、10（2.66 mg/L）、1 μmol/L（0.27 mg/L）的药液，加入Oligo（dT）15包被板中，最终用酶标仪测定405 nm波长处OD值，计算各加药组OD值/空白对照组OD值，判断药物对HIV逆转录酶的影响。 结果 与空白对照组相比，水芹总酚酸对HIV逆转录酶活性有较强的抑制作用，高、中、低剂量组的OD值分别为（0.316±0.033）、（0.442±0.044）、（0.627±0.009）；平均抑制率分别为85.20%、73.67%和55.83%，具有良好的量效关系（P 　　[关键词] 水芹总酚酸；HIV逆转录酶；酶联免疫 　　[中图分类号] R969.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）04（c）-0004-03 　　水芹是我国的传统中药，文献报道水芹具有良好的保肝降酶退黄作用[1]。研究表明，水芹总酚酸（total phenolics acid extracted from Oenanthe Javanica，OJTPA）是水芹的有效成分之一，体内外实验均表明其对乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）的复制有较强的抑制作用。水芹总酚酸能够有效抑制HepG2 2.2.15细胞的HBV DNA、共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）、乙肝病毒表面抗原（HBsAg）以及乙肝病毒e抗原（HBeAg）水平[2]。此外，在以感染鸭乙肝病毒（duck hepatitis B virus，DHBV）的北京雏鸭为模型的试验中，OJTPA同样能够有效抑制DHBV的复制[3]。由于某些具有抗HBV活性的药物，例如：拉米夫定（Lamivudine，LAM）、替诺福韦（Tenofovir，TDF），同时能够抑制人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的复制，因此本研究通过HIV逆转录酶抑制剂酶联免疫的测定方法探讨OJTPA对HIV逆转录酶活性的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 药物 　　OJTPA：解放军第三?二医院药学部制备（批号：110415）。奈韦拉平（NVP 上海迪赛诺制药有限公司，批号：DH027-4-0409016）。 　　1.2 试剂 　　二甲基亚砜（Sigma公司，批号，DTT（Ameresco公司，批号：2502C321），Poly A（Roche公司，批号，PNPP（Sigma公司），DUTP（上海生工合成），DTTP（Takara公司，批号：CB6901A），Oligo（dT）15（由大连宝生物工程有限公司合成），小牛血清白蛋白（BSA北京中美转导科技公司），HIV逆转录酶（Calbiochemn公司，批号：，Tris（北京Biodee公司），碱磷酶标记链亲和素（APS，中山金桥公司），MgCl2?6H2O、KCl、NaOH（均为北京化工厂产品）。 　　1.3 仪器 　　低温高速离心机（SIGMA 3-18K），电子分析天平（上海宇恒平科学仪器），96孔细胞培养板（丹麦NUNC公司），酶联仪（美国BIO-RAD），漩涡混匀器（海门其林贝尔仪器制造），恒温水浴锅（Grant公司）。 　　1.4 方法 　　1.4.1 Oligo（dT）15包被板的制备 　　将Oligo（dT）15溶于100 mmol/L的1-甲基-咪唑的盐酸缓冲液中（pH 7.4），加入96孔酶标板中，与水溶性碳化二亚胺混匀，于50℃水浴中反应4 h，反应结束后用洗液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）洗3遍，除去未结合的Oligo（dT）15，将包被后的96孔板置4℃保存。 　　1.4.2 药液的配制 　　水芹总酚酸用DMSO和PBS配成10、1、0.1 mg/L的药液，阳性对照药奈韦拉平（NVP）用DMSO和PBS配成50、10、1 μmol/L的药液。 　　1.4.3 HIV逆转录酶活性检测 　　1.4.3.1 将药液分别加入到用PBS洗过的96孔培养板中，每孔10 μL，每浓度3孔。反应体系如下：70 μL的RT Buffer，20 μL含逆转录酶的PBS溶液，使反应系统总体积为100 μL[其中含50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，3 mmol/L MgCl2，75 mmol/L KCl，5 mmol/L DT