柚皮苷促进人牙周膜成纤维细胞成骨分化能力研究.docVIP

柚皮苷促进人牙周膜成纤维细胞成骨分化能力研究 　　[摘要]目的：研究柚皮苷对体外培养的人牙周膜成纤维细胞（HPDLCs）成骨分化能力的影响。方法：组织块法培养原代HPDLCs，加入含不同浓度柚皮苷的培养液（100、10、1、0.1、0.01 mg/L），用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测HPDLCs的培养上清液中ALP的活性，用实时定量PCR检测加入柚皮苷后不同时间点（24h、48h、72h），HPDLCs的骨形成蛋白2（BMP2）、I型胶原蛋白（Col I）、骨保护蛋白（OPG）和核因子κb受体活化因子配体（RANKL）的mRNA表达水平的变化。结果：与对照组比较，不同浓度柚皮苷试验组HPDLCs培养上清液中的ALP活性显著增高（P 　　[关键词]柚皮苷；人牙周膜成纤维细胞；骨形成蛋白2；骨保护蛋白 　　[中图分类号]R782 Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）03-0355-05 　　柚皮苷（Naringin）全称为柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，是一种双氢黄酮类化合物，主要存在于芸香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中，是骨碎补的主要活性成分[1]。Zhang等[2]的研究证实柚皮苷可以促进骨基质干细胞的增殖并且向成骨细胞的分化。牙周膜细胞在牙周组织的再生和修复中起重要作用。最新研究表明，柚皮苷可以促进牙周膜细胞的增殖和成骨分化的潜能[3-7]。然而，柚皮苷通过何种分子途径促进牙周膜细胞的成骨分化尚未见报道。 　　本研究旨在观察柚皮苷对体外培养的人牙周膜细胞的分化能力的影响，进一步探讨其促进牙周组织改建的分子生物学基础。 　　1 材料和方法 　　1.1主要试剂与仪器：柚皮苷（中国药品生物制品检定所，用含10%FBS的DMEM配制，浓度为100、10、1、0.1、0.01mg/L）胎牛血清（FBS， Gibco，美国），DMEM培养基（Gibco，美国），胰蛋白酶（Gibco，美国），双抗 （青霉素100U/L、链霉素100μg/L，Sigma公司，美国），ALP检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），MTT（Sigma公司，美国），二甲基亚砜（DMSO，天津汇英化学试剂有限公司），酶联免疫检测仪（Bio Tek公司，美国）， TRIZOL Reagent（Invitrogen，美国），PrimeScriptTM RT-PCR试剂盒 （Perfect Real Time，Takara Bio公司）。 　　1.2人牙周膜细胞的体外培养：牙周组织样本来自于本院口腔科门诊。选取3个健康个体，因正畸治疗需要拔除的正畸牙6颗，平均年龄12～14岁。临床检查排除急性感染、全身系统性疾病史、家族遗传病史、吸烟史、特殊服药史以及牙体及根尖病变。本实验所用牙齿均经过患者本人同意，并签署了知情同意书。原代PDLSCs培养方法参照文献[8]进行，无菌条件下刮取根中1/3的牙周膜组织，采用组织块法进行原代培养及常规传代培养。取3～5代细胞用于本实验。 　　1.3 ALP活性检测：将对数生长的HPDLCs细胞制成细胞悬液，接种于96孔板，每孔1×104细胞。置于37℃、5%CO2，用含10% FBS的DMEM培养24h后，弃去培养液及未贴壁的细胞，再换无血清的DMEM培养液孵育24 h，分别于每孔加入含终浓度为100、10、1、0.1、0.01mg/L柚皮苷的培养液，以不含柚皮苷的培养液作为阴性对照组，每组设4个复孔。于培养后24h、48h、72h，收集上清液，采用ELISA试剂盒检测各组HPDLCs上清液中ALP的浓度，每孔加入ALP反应底物100μl，37℃孵育30 min，0.2 mol/L NaOH 50μl终止反应，在酶联免疫检测仪上410nm波长处测定各孔A值，每个样品重复检测3次，结果取均值，根据标准品的浓度计算ALP的活性（U/ml）。 　　1.4 总RNA的提取：将对数生长的HPDLCs细胞制成细胞悬液，接种于6孔板，每孔1×106细胞。置于37℃、5%CO2，用含10% FBS的DMEM培养24h后，弃去培养液及未贴壁的细胞，再换无血清的DMEM培养液孵育24h，分别于每孔加入含终浓度为1mg/L柚皮苷的培养液，以不含柚皮苷的培养液作为阴性对照组，于培养后24h、48h、72h，分别收集细胞，采用酚-氯仿提取法提取RNA，具体步骤按照TRIZOL Reagent产品说明书进行。 　　1.5 Real-time PCR：将已测得浓度的RNA按照PrimeScriptTM RT-PCR Kit （Perfect Real Time） 试剂盒反转录cDNA。按照SYBRR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）试剂盒说明书，将cDNA加入扩增体系。使用2