凡纳滨对虾儿茶酚―氧位―基转移酶cDNA序列克隆及组织表达分析.docVIP

凡纳滨对虾儿茶酚―氧位―甲基转移酶cDNA序列克隆及组织表达分析 　　摘要：利用RACE （rapid amplification of cDNA ends）技术，克隆了凡纳滨对虾儿茶酚-氧位-甲基转移酶（catechol-O-methyltransferase，COMT）基因cDNA序列。该基因（LvCOMT）cDNA全长910 bp（GenBank登录号JQ345478），含有666 bp的开放阅读框（ORF），编码221个氨基酸，理论分子量74.9 ku，等电点4.98。经软件分析，该成熟肽有12个磷酸化的氨基酸位点，不具信号肽，推测凡纳滨对虾COMT基因可能是依赖12个可能的氨基酸发生可逆的磷酸化反应来进行调控作用。LvCOMT基因与斑节对虾、中国明对虾的氧位-甲基转移酶具有高度相似性，系统进化分析表明，LvCOMT在亲缘关系上更接近于哺乳动物的儿茶酚-氧位-甲基转移酶。应用RQ-PCR分析COMT在凡纳滨对虾中的组织特异性分布，结果显示COMT在肝胰腺组织中表达量最高，在鳃中的表达量最低。 中国论文网 /1/viewhtm　　关键词：凡纳滨对虾；儿茶酚-氧位-甲基转移酶；基因克隆；表达 　　中图分类号： S917；Q786文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）02-0026-05 　　收稿日期：2015-03-06 　　基金项目：长江大学博士启动经费（编号：8012000101122）；广东省海洋生物技术重点实验室开放基金（编号：GPKLMB201403）。 　　作者简介：郜卫华（1977―），女，湖北襄阳人，博士，讲师，主要从事水产分子营养学研究。E-mail：gwh@126.com。 　　通信作者：许巧情，博士，教授，主要从事水产分子生物学研究。E-mail。 　　氧位-甲基转移酶（O-methyltransferase，OMT）是一种转甲基酶，在真菌[1]、细菌[2]、植物[3]等多种生物中普遍存在。根据甲基受体分子不同，氧位-甲基转移酶的种类也有所不同。在动物中研究最多的2种氧位-甲基转移酶是法呢酸-氧位-甲基转移酶（farnesoic acid-O-methyltransferase，FAMeT）、儿茶酚-氧位-甲基转移酶（catechol-O-methyltransferase，COMT）。COMT是1958年首先在人体中发现的一种重要代谢酶，广泛存在于机体各种组织中，如脑、肝、肾、肺等，其主要功能是代谢具有毒性或生物活性的儿茶酚胺类物质及降解外界系统的多巴胺[4]。迄今为止，已公布甲壳动物的法呢酸-氧位-甲基转移酶序列包括斑节对虾（Penaeus monodon）（AY823409）、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）（AY823408）、刀额新对虾（Metapenaeus ensis）（AF333042）、断沟龙虾（Penulirus interruptus）（AF249871）、日本长额对虾（Pandalopsis japonica）（HQ399440）、拟穴青蟹（Scylla paramamosain）（HQ587049）、中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）（GQ861517）、黄道蟹（Cancer pagurus）[5]；而甲壳动物儿茶酚-氧位-甲基转移酶的序列仅在中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）（DQ091255）和斑节对虾（Penaeus monodon）（JN572540）中发现。据报道，水产动物的OMTs基因参与病原和细菌感染后的免疫反应[6-7]，其中COMT在动物中是否参与免疫反应尚未见报道。本研究以凡纳滨对虾为材料，通过RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术克隆获得凡纳滨对虾COMT基因全长，并对其进行生物信息学分析，进一步利用荧光定量PCR技术对该基因的组织特异性分布进行分析，以期为该基因免疫作用研究奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1供试动物 　　试验用虾购自广东海兴农生物科技有限公司，于广东海洋大学东海岛实验基地水泥池暂养1周。取健康凡纳滨对虾，经灭菌焦碳酸二乙酯（DEPC）水清洗后，先将其冰浴麻醉，冰浴条件下分离肝胰腺、鳃、胃、肠、心脏等5种组织，迅速装入1.5 mL eppendorf离心管（RNase free），并立即投入液氮速冻，后转移至-80 ℃冰箱保存备用。 　　1.2总RNA的提取 　　取凡纳滨对虾肝胰腺、鳃、胃、肠、心脏等5种组织，按照联合基因的Unizol Reagent（GENEray biotechnology，China）操作步骤，研磨、裂解组织后提取总RNA，经1.5%琼脂