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京大戟毒性部位及其醋制前后成分变化研究 　　[摘要] 为比较京大戟不同极性部位的肠道毒性作用，分析毒性部位醋制前后成分变化规律，该实验以95%乙醇提取京大戟，石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯依次萃取得不同极性部位。不同极性部位小鼠灌胃3 h后，测定粪便含水量及十二指肠、空肠、回肠、结肠含水量，考察不同极性部位对小鼠腹泻及肠道水肿的影响；采用MTT法比较不同极性部位对大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC6细胞的增殖抑制作用，并采用RTPCR法测定结肠中水通道蛋白AQP1，AQP3的mRNA表达水平，考察不同极性部位的毒性。研究结果显示，与空白组相比，京大戟醇部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位均可导致小鼠粪便含水量及十二指肠及结肠的含水量增高，石油醚部位作用最强。京大戟95%醇提物、石油醚部位对IEC6细胞具有显著的增殖抑制作用，IC50分别为95.03，33.75 mg?L-1；京大戟95%醇提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位均能导致结肠中AQP1的mRNA表达降低、AQP3的mRNA表达增高。表明京大戟可导致小鼠腹泻及肠道水肿，其作用与导致水通道蛋白AQP1，AQP3的mRNA表达水平变化相关；并可抑制IEC6细胞增殖；京大戟的主要毒性部位为石油醚部位，通过成分分离及炮制前后成分变化比较，发现毒性的降低可能与石油醚部位的二萜类成分含量下降相关。 中国论文网 /1/viewhtm　　[关键词] 京大戟；肠道毒性；IEC6；水通道蛋白；醋制 　　京大戟为大戟科植物大戟Euphorbia pekinensis Rupr. （ER） 的干燥根，性味苦，寒；有毒；归肺、脾、肾经，具有泄水逐饮、消肿散结的功效，常用于水肿胀满、胸腹积水、痰饮积聚、气喘逆咳，二便不利等[1]。课题组前期研究表明，京大戟生品存在明显的胃肠道毒性及炎症刺激性作用[2]，有报道亦提出京大戟对多种细胞具有毒性作用[34]，故临床使用时常采用其醋制品，以减轻毒性反应。目前对于京大戟的研究集中在炮制解毒研究[25]及毒性二萜类成分的分离[610]，而对于其临床毒性表现与毒性成分之间的相关性及炮制解毒的机制研究较少。 　　水通道蛋白（AQPs）是一类具有特异孔道结构的跨膜蛋白，能够介导水分子和甘油分子的通透，迄今共发现13个亚型（AQP0～AQP12），水通道蛋白在胃肠道中有大量的表达，对于维持胃肠道水液平衡具有重要作用[11]。人体的结肠组织每天吸收1.5～2 L的水液，对于粪便的形成发挥着重要作用，在结肠组织中表达的蛋白有AQP1，AQP3，AQP4等。研究发现，增加结肠中AQP3的表达能够导致腹泻的产生[1213]。因此，本实验在整体动物水平采用灌胃给药方式，在小鼠灌胃3 h后收集粪便，测量粪便含水量；并测定小鼠十二指肠、空肠、回肠、结肠含水量，考察京大戟各部位对肠道水液代谢干扰作用的强弱；同时在细胞水平以IEC6细胞为研究对象，比较不同极性部位对IEC6细胞的增殖抑制作用，在分子水平采用RTPCR法测定结肠中AQP1，AQP3的mRNA表达水平，考察不同极性部位的毒性。得到最强毒性部位，并进行系统分离，得到毒性成分，再采用MTT法测定各成分对IEC6细胞的增殖抑制作用，验证其毒性；以液质联用的方法分析炮制前后最强毒性部位成分变化，最终揭示京大戟肠道毒性的物质基础及毒性作用机制，初步阐明炮制解毒的机制。 　　1材料 　　1.1药材和试剂 　　京大戟购自河北安国药材市场，经江苏省食品药品检验所胡皓彬主任药师鉴定为大戟科植物大戟E. pekinensis的干燥根。 　　0.2 mL 96孔半裙边PCR板（赛业生物科技，DPDPP022C1）；羧甲基纤维素钠（国药集团化学试剂有限公司）；胎牛血清（美国WISENT 公司）；RPMI 1640培养液（美国Hyclone公司）；青链霉素混合液（无锡海硕生物有限公司）；生理盐水（南京小营药业集团）；PBS缓冲液（Thermo公司）；石油醚（南京化学试剂有限公司）；二氯甲烷（南京化学试剂有限公司）；乙酸乙酯（南京化学试剂有限公司）；二甲亚枫（南京化学试剂有限公司）；其余试剂均为分析纯 。 　　1.2仪器 　　SpringS15i超纯水发生器；KQ500DE型医用数控超声清洗器；Rotavapor R210旋转蒸发仪（BUCHI）；HH2K4二列四孔智能水浴锅（南京科尔仪器设备有限公司）；BP211D电子天平（德国Sartorius公司）；Spectra Max 190酶标仪（美国AD公司）；德国Bruker Avance AV500/300核磁共振仪（TMS为内标）； 7500 Real Time PCR System（ABI）；HPLCMS/MS 液质联用仪 （Triple TOFTM 5600， AB SCIEX， CA）。