口腔标本检测男性不育症Y色体微缺失.docVIP

口腔标本检测男性不育症Y染色体微缺失 　　摘要：目的：通过探讨男性不育症同一个体口腔脱落细胞和血液检测AZF缺失的关系，研究口腔脱落细胞检测AZF的可行性。方法：选择128例研究对象，其中少弱精症、无精症128例，应用多重PCR技术，分别检测口腔脱落细胞、血液基因组中 AZF区域的Y染色体微缺失。结果：同一个体检测AZF缺失情况，口腔脱落细胞和血液是完全一致。结论：在进行 Y染色体微缺失筛查中，口腔脱落细胞检测AZF作为一种简便、无创、准确的方法，是完全可以替代血液AZF检测。 中国论文网 /6/viewhtm　　关键词：Y染色体微缺失；不育症；口腔脱落细胞；基因诊断 　　【中图分类号】R265【文献标识码】A【文章编号】1672-3783（2013）12-0005-02 　　不育症的患病率正在逐年上升，一年以上有规律性生活不能怀孕的夫妇约占所有新婚夫妇的10%，男性不育因素占40%左右[1]。其中不育症有30%的病因是无法解释的，有研究发现 Y染色体微缺失与男性生精功能有关，特别是 AZF基因微缺失。约有15%的原发生精障碍患者由Y染色体AZF微缺失所引起[2]。目前在基因诊断检测AZF中，通常采用血液提取DNA，采用口腔脱落细胞提取DNA[3]较少。血液样本处理比较复杂且有创，无法大规模在不育症患者中进行AZF微缺失筛查及AZF微缺失家系调查。本实验通过口腔脱落细胞和血液基因组AZF的检测和比较，对口腔脱落细胞检测AZF的可行性和准确性进行评估、探讨，旨在找到一种简便、无创、准确的检测方法。 　　1材料和方法 　　1.1研究对象：在泌尿科门诊和不孕不育门诊，选取128例研究对象，其中少弱精症、无精子症128例，平均年龄30±0.48岁；少弱精症、无精子症诊断标准按照1999版《WHO人类精液及精子-宫颈粘液互相作用实验室检验手册》，检测前抽静脉血检查染色体核型 （G显带技术）、抗精子抗体 （ELISA）及血清激素水平 （卵泡刺激素、黄体生成素、睾酮，放射免疫测定法）。1例正常女性为阴性对照。 　　1.2仪器和材料：H.Q.Q.血液DNA提取试剂盒（安徽优晶生物工程有限公司），往复式水浴恒温振荡器（SHZ-88A，太仓市实验设备厂），台式小离心仪，15ml小离心管，无水乙醇――每个样品大约0.3ml，异丙醇――每个样品大约03ml，EB液，PCR体系，电泳仪，凝胶成像仪，PCR仪。 　　1.3实验方法：在所有研究对象分成口腔脱落细胞组和血液细胞组。第一步：每个受试者用抗凝管取外周血3ml，不能使用肝素抗凝，使用EDTA（乙二胺四乙酸）或ACD（柠檬酸，柠檬酸钠，葡萄糖）抗凝，加入抗凝剂后混匀，放进-20℃冰箱保存。第二步：每个受试对象统一编号，血液样本加注B （blood）和漱口液样本加注O（oral）。如同一受试对象血液样本标识为B漱口液样本标识为O其它编号依次类推。 　　实验按照欧洲男科协会（EAA）和欧洲分子遗传质控协会（EMQN）2004版标准进行检测，选取Y染色体常见的微缺失位点STS位点（sY84、 sY86、sY127、 sY134、sY254、sY255）进行 PCR扩增检测，同时选取男性性别决定基因 SRY作为内对照，女性作为阴性对照，水作为空白对照。 　　合成的 SRY、sY84、sY86、 sY127、 sY134、sY254、 sY255等引物由见下表1。 　　口腔脱落细胞样本和血液样本按均按以下步骤进行实验： 　　（1）1.5mlEP管 （Eppendorf管）加OB蛋白酶25ul。 　　（2）加xy缓冲液250ul。 　　（3）加样本250ul，上下颠倒混匀。 　　（4）水浴70℃ 20分钟，颠倒混匀一次。 　　（5）加无水乙醇260ul， 颠倒混匀。 　　（6）标本转移至含硅胶柱收集管，离心13000r/min，2min，弃收集管及流出液。 　　（7）用一新收集管，加DNA洗涤缓冲液710ul，离心13000r/min，2min，弃收集管及流出液。 　　（8）用一新收集管，加DNA洗涤缓冲液710ul，离心13000r/min，2min，弃收集管及流出液。 　　（9）用一新收集管，离心13000r/min，2min，弃收集管及流出液。 　　（10）硅胶柱转移至1.5mlEP管，加DNA洗脱缓冲液25ul，离心13000r/min，2min，弃硅胶柱。 　　（11）取上述1.5mlEP管中液（含DNA样本模版）2ul，加入PCR体系20ul，加入引物9ul。 　　（12）放入PCR仪，94℃ 2.5min，95℃ 0.5 min，59℃ 0.5 min，72℃ 0.5 min，35个循环，72℃ 5min。 　　（13）取PCR液0.3