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创建酿酒酵母细胞工厂发酵生产羽扇豆醇お 　　[摘要]羽扇豆醇、桦木酸等羽扇豆型三萜化合物具有抗HIV、抗肿瘤等多种生物学活性，其中羽扇豆醇为这类化合物的基本前体。为了实现羽扇豆烷型三萜的异源发酵法生产，研究首先运用高通量同源重组法在酿酒酵母中进行萜类甲羟戊酸（MVA）途径的一步法调控，以提高三萜通用前体鲨烯的供给；在进一步工作中，拟南芥来源的羽扇豆醇合成酶基因（AtLUP）被整入三萜底盘菌株中实现羽扇豆醇酵母人工细胞工厂的创建。结果表明该实验能一次完成MVA途径的7个基因的整合，组装总长度达到20kb，同时多倍化MVA途径能显著提高鲨烯产量约500倍，达到35400 mg?L-1；AtLUP基因在染色体上整合后获得的工程菌NK2LUP在摇瓶中发酵能生产823 mg?L-1羽扇豆醇。该研究可为在酵母中实施大规模生物合成途径组装提供技术支持，同时为进一步获高产羽扇豆烷型三萜的人工酵母细胞提供了重要基础。 中国论文网 /1/viewhtm　　[关键词]三萜；羽扇豆醇；合成生物学；酿酒酵母 　　羽扇豆烷型（lupanetype）三萜是一类药用植物中微量合成的五环三萜类次生代谢物，主要包括羽扇豆醇（lupeol）、桦木酸（betulinic acid）和相应的衍生物[1]。其中，羽扇豆醇是这类化合物生物合成的基本前体物质。在植物细胞中，它可以在P450氧化酶的催化作用下发生C28位氧化，依次转化成桦木醇、桦木醛并最终氧化成桦木酸[24]。1995年Pisha等[5]发现了桦木酸具有较高选择性的抗黑色素瘤活性后，其出色的抗HIV活性也被人们发现[67]。目前，桦木酸和桦木酸衍生物Bevirimat已作为抗黑色素瘤药物或抗HIV的候选药物进入临床研究阶段[8]，然而，桦木酸在桦木中的含量只有0025%[9]，新的资源途径迫切需要解决。 　　酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae是一种生物安全的模式真核生物，其遗传背景清晰，遗传改造策略及发酵方法成熟，已被广泛应用于构建生产青蒿素[10]，人参皂苷[1112]，番茄红素[13]和β胡萝卜素[14]等天然萜类活性物质的底盘工程菌株。异戊烯焦磷酸（IPP，isopentenyl pyrophosphate）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP，dimethylallyl pyrophosphate）为萜类生物合成的基本单元，自然界可经乙酰辅酶A乙酰基转移酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶、3羟基3甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶和异戊烯焦磷酸异构酶等7个酶组成的甲羟戊酸途径（MVA pathway）合成。IPP和DMAPP可依次在法呢基焦磷酸合成酶和鲨烯合酶的催化作用下合成三萜通用前体鲨烯（squalene）。在酿酒酵母中，鲨烯可以继续被鲨烯环氧酶氧化为环氧鲨烯（2，3oxidosqualene），继而可以被羊毛甾醇环合酶等酶催化生成羊毛甾醇（lanosterol）和麦角固醇（ergosterol）等物质。在其他物种中，环氧鲨烯也可以被不同类型的环氧鲨烯环化酶催化生成各种类型的三萜母核，如β香树脂，葫芦二烯醇和羽扇豆醇等[1]，见图1。其中，羽扇豆醇能被桦木酸合成酶催化生成桦木酸[24]。 　　在本研究中，首先运用高通量同源重组法在酿酒酵母CENPK21D中进行萜类甲羟戊酸（MVA）全途径基因的一步法整合调控，实现多基因、超长度、高精度的基因组定点整合，获得鲨烯（三萜通用前体）含量显著提高的底盘菌；在此基础上，通过整合拟南芥Arabidopsis thaliana来源的羽扇豆醇合成 　　酶基因（AtLUP），构建出羽扇豆醇的生物合成途径，为构建高产羽扇豆烷型三萜酿酒酵母细胞工厂提供基础，同时为酵母中实现大规模生物合成途径精确组装提供技术支持。 　　1材料 　　11工具酶与试剂PrimeSTAR HS DNA聚合酶购自于大连宝生物工程公司；酵母基因组DNA提取试剂盒购自北京康为世纪有限公司；质粒小量快速提取试剂盒购自美国Axygen公司；氨苄青霉素、DNA清洁试剂盒与DNA回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母选择培养基购自北京泛基诺科技有限公司；羊毛甾醇、麦角固醇、鲨烯和羽扇豆醇对照品购自美国SigmaAldrich公司；其他试剂均为分析纯。 　　12质粒，菌株及引物本次研究所用的质粒，菌株及引物信息见表1，2。 　　13培养基LB培养基：1%蛋白胨，05%酵母粉，1%氯化钠，100 mg?L-1氨苄青霉素；SM[Ura]筛选培养基：08%酵母选择培养基（三缺，UraTrpHis），2%葡萄糖，001%Trp，001%His；SM[UraTrp]筛选培养基：08%酵母选择培养基（三缺，UraTrpHis），2