一株高产壳聚糖酶细菌筛选及发酵条件优化.docVIP

一株高产壳聚糖酶细菌筛选及发酵条件优化 　　摘要：壳聚糖（Chitosan）及其降解产物因具有优良的物理特性和生物活性而被广泛关注。研究通过平板透明圈初筛、摇瓶复筛方法，从青岛海岸土壤中分离筛选到1株产壳聚糖酶活性较高的细菌K1，并对其产酶发酵条件进行了单因子优化试验。结果表明，经16S rDNA序列分析，K1菌株被鉴定为Mitsuaria sp. K1（GenBank登录号：KC489157）；最适产酶发酵条件为1.0%（m/V，下同）粉末壳聚糖，0.5%硝酸钾，0.22%KH2PO4，0.1%Na2HPO4，0.15%KCl，0.05%MgSO4?7H2O，碳源∶氮源=2∶1，培养基初始pH 6.5，接种量3.0%（V/V），摇瓶装液量100 mL，培养温度25 ℃，培养时间24 h。在最适条件下，K1菌株发酵液中壳聚糖酶活最高可达到11.50 U/mL，是优化前酶活的5.3倍，且发酵温度较低，产酶周期较短，具有较高的工业发酵应用价值。 　　关键词：壳聚糖酶；细菌；筛选；发酵条件；优化 　　中图分类号：TQ920.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）03-0517-05 　　壳聚糖[（1，4）-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖]，是天然多糖中为数不多的含阳离子高分子聚合物[1]。因其具有高生物相容性、易成膜性、安全性、生物降解性等特征而被各行业高度重视[2]。壳聚糖的进一步降解产物为一系列具有生物活性功能的低分子壳寡糖和氨基葡萄糖，具有抗菌、调节机体免疫、抗肿瘤及促进农作物增产等功效，故在食品、医药等领域中具有广阔的应用前景[3]。壳聚糖来自于其前体物质甲壳质[（1，4）-2-乙酰氨基-2-β-脱氧-D-葡萄糖，脱乙酰后成为壳聚糖]，在自然界中分布极为广泛（存在于各类节肢动物、软体动物、环节动物和某些真菌中）[4]，是地球上数量仅次于纤维素的含氮有机化合物。 　　目前，降解壳聚糖的方法有化学法、物理法、酶解法、电化学法等[5]，其中酶解法主要是利用微生物产酶来制备壳寡糖。因该法具有特异性强、节能、环保、安全等优势而成为国际研究热点。 　　自然界存在很多微生物能够产生降解甲壳质和壳聚糖的酶，然而它们的产酶能力却受物种、培养条件等多种内外因素的影响[6]。因此分离筛选高效产酶微生物并对其产酶条件进行研究是酶解法降解壳聚糖的基础。本研究通过平板透明圈初筛、液体发酵复筛等方法，从青岛沿海岸边虾壳、贝壳堆积土壤和生物工程公司排污口土壤中分离筛选到一株产活性较高壳聚糖酶的细菌，通过单因子试验对该菌的产酶发酵条件进行了前期探索，并对其分类地位进行了初步的鉴定，将为后续该菌株在工业发酵上的应用打下基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 菌种来源 　　土壤样品采集自青岛沿海岸边虾壳、贝壳堆积土壤和某生物工程公司排污口处土壤。样品采集后保存于4 ℃冰箱备用。 　　1.2 菌株平板透明圈初筛 　　称取0.5 g土样于无菌水中，振荡摇匀静置6 h后悬液做梯度稀释，然后涂布于初筛平板上（培养基A液：胶体壳聚糖1.0 g，去离子水100 mL，pH 6.2；B液：KH2PO4 0.22 g，Na2HPO4 0.1 g，KCl 0.15 g，MgSO4?7H2O 0.05 g，CaCl2 0.002 g，KNO3 0.5 g，葡萄糖0.1 g，酵母膏0.1 g，琼脂3 g，去离子水100 mL，pH 6.0；A液、B液分别于115 ℃灭菌30 min后，按体积比1∶1混合均匀倒平板），30 ℃培养3～5 d。挑取产透明圈的菌株，再接入新制初筛平板上划线分离单菌落。挑取生长良好、透明圈明显的单菌落，测量透明圈直径（D）和菌落直径（d），选取二者比值（D/d）较大者保存斜面备用。 　　胶体壳聚糖的制备方法参考文献[7]：将6 g壳聚糖粉末和400 mL 0.2 mol/L的HCl加入均质机中，搅拌1 min至完全溶解，期间缓慢滴加2 mol/L的NaOH溶液调pH至9.0，使壳聚糖完全以白色乳状胶体析出。将壳聚糖胶体于5 000 r/min 离心沉淀15 min，去上清液，用去离子水反复冲洗沉淀至上清液pH呈中性。然后在均质机搅拌下用0.2 mol/L的HCl溶液调pH至6.2，使壳聚糖完全溶解，补足去离子水至总体积为600 mL，115 ℃灭菌30 min，4 ℃冰箱保存备用。 　　1.3 菌株摇瓶发酵复筛 　　将活化好的初筛菌株斜面接入LB液体培养基中30 ℃扩大培养，然后再以5%（V/V，下同）的接种量接入发酵培养基（配方：粉末壳聚糖1.0 g，KH2PO4 0.22 g，Na2HPO4 0.1 g，KCl 0.15 g，MgSO4?7H2O 0.05 g，CaCl2 0.002 g，KNO3 0.5 g，去离子水100