一步法制备大肠杆菌L21DE3菌株感受态细胞及转化条件优化.docVIP

一步法制备大肠杆菌BL21DE3菌株感受态细胞及转化条件优化 　　摘要：大肠杆菌BL21（DE3）菌株是大肠杆菌表达系统最常用的宿主菌株，因此人们需要1种便捷有效的感受态细胞制备和转化方法。一步法感受态细胞制备操作方便，只加1种试剂即可，更快捷稳定，转化也更方便，不需要热激。研究大肠杆菌感受态细胞一步法制备对BL21菌株的适用性，并对转化过程中的关键参数进行探索和优化。结果表明，该一步法制备的BL21菌株感受态细胞可获得106 CFU/μg DNA转化效率，完全能够满足常规转化要求。转化过程中相关参数的最佳条件为冰水浴30 min，室温放置10 min，37 ℃、150 r/min振荡复苏40 min。 中国论文网 /1/viewhtm　　关键词：感受态细胞制备；一步法；大肠杆菌BL21（DE3）菌株；转化条件 　　中图分类号： X172文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）12-0529-03 　　收稿日期：2015-11-04 　　基金项目：国家自然科学基金青年科学基金（编号；江苏省高等学校大学生创新训练计划（编号：201310323046X）。 　　作者简介：张迹（1982―），男，江苏宿迁人，博士，讲师，主要从事环境污染物微生物降解及污染环境微生物修复研究。E-mail：zhangjihnu@163.com。 　　在分子生物学试验中，DNA重组技术和外源基因的表达是最常用的研究手段之一，质粒转化进入大肠杆菌感受态细胞是其频繁使用的一项基本操作技术。这项技术分为2个部分，即大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA的转化。目前，制备感受态细胞最常用的方法是CaCl2法[1-2]和电穿孔法[3]。电转化法转化效率高，但是需要一套特殊仪器，操作过程也很繁琐；CaCl2法不需要特殊仪器，操作简便，重复性好，但耗时较长[4]。1989年Chung等报道了一步法制备大肠杆菌感受态细胞，该法操作简便、快捷、重复性好，获得单位质量转化效率达到107～108个/μg单位质量的转化子，能够满足常规试验要求，并可在-70 ℃下长期保存。一步法感受态细胞制备及其转化法适用于DH5α、HB101、JM109等多个大肠杆菌常用菌株[5]。 　　大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统[6]，而大肠杆菌BL21（DE3）菌株是该表达系统最常用的宿主菌株[7]，需要便捷有效的感受态细胞制备和转化方法。本研究采用一步法制备大肠杆菌BL21菌株的感受态细胞，研究该方法对BL21菌株的适用性，并对转化过程中的关键参数进行探索和优化。 　　1材料与方法 　　1.1菌株与质粒 　　供试菌株：大肠杆菌BL21（DE3）菌株，由笔者所在实验室保存。 　　供试质粒：PUC19（2 686 bp）、pET29a（5 371 bp）、pET29a-gfp（5 948 bp）。 　　1.2试剂 　　质粒抽提试剂盒，购自爱思进生物技术（杭州）有限公司；IPTG、X-GaL、PEG3350、相关抗生素，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。其他常规试剂均为国产分析纯。 　　1.3主要培养基和溶液配方 　　LB培养基（1 L）：蛋白胨（Tryptone，OXCID）10.0 g；酵母提取物（Yeast extract，OXCID）5.0 g；NaCl 5.0 g；用去离子水补足1 000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。配制固体培养基时加入2%琼脂。 　　转化与贮存溶液（TSS）：液体LB培养基调pH值为6.5，含10% PEG3350，5%二甲基亚砜（DMSO），10%甘油，MgCl2 10 mmol/L，MgSO4 10 mmol/L，高压蒸汽灭菌。 　　5×KCM溶液：KCl 0.5 mol/L，CaCl2 0.15 mol/L，MgCl2 0.25 mol/L。该溶液仅需少量配制（以mL计），过滤除菌，分装成小份于-20 ℃保存备用，可反复冻融。 　　1.4大肠杆菌BL21菌株一步法感受态细胞的制备 　　制备方法参照文献[5]所介绍的一步法。活化大肠杆菌BL21菌株，从37 ℃培养过夜的新鲜LB平板中挑取BL21单菌落，接种到3 mL LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养过夜；取1 mL过夜培养菌液接种入100 mL液体LB培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养至D600 nm=0.3～0.5（约3 h）；将培养液转移到灭菌的50 mL离心管中，置冰上10 min；4 ℃、6 000 r/min离心5 min，弃上清；用10 mL预冷的无菌TSS重悬菌体细胞；冰上放置10 min，分装120 μL/管（在冰上操作），-70 ℃保存备用。 　　1.5大肠杆菌一步法感受态