吡格列酮对家兔局灶性脑缺血再灌注损伤细胞凋亡影响.docVIP

吡格列酮对家兔局灶性脑缺血再灌注损伤细胞凋亡影响 　　[摘要] 目的 探讨吡格列酮对脑缺血再灌注损伤家兔细胞凋亡的影响及其机制。 方法 40只雄性家兔随机分为5组：①假手术组（S组，n = 8）；②模型组（M组，n = 8）；③吡格列酮组（P组，n = 8）；④GW9662+吡格列酮组（GP组，n = 8）；⑤DMSO组（D组，n = 8）。除S组外，其余各组均通过线栓法建立家兔大脑中动脉阻塞（MCAO）再灌注损伤模型。于术前30 min分别给予相应处理。缺血120 min再灌注24 h后，对家兔进行神经功能评分；HE染色观察病理形态学，TUNEL检测神经细胞凋亡。 结果 ①与S组比较，M组神经功能评分明显增加（P 　　[关键词] 吡格列酮；GW9662；脑缺血/再灌注；细胞凋亡 　　[中图分类号] R743.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）04-0001-03 　　近年研究表明，PPARγ表达的升高对于脑缺血再灌注损伤具有一定的神经保护作用[1]，已成为脑血管病研究领域中的热点课题。作为PPARγ的激活配体――吡格列酮（pioglitazone，PGZ）临床上广泛应用于治疗2型糖尿病，但有研究表明其对脑缺血再灌注损伤具有一定的神经保护作用[2]，而具体机制尚未完全阐明。本实验采用家兔局灶性脑缺血再灌注模型，应用PGZ进行预处理，观察其对家兔术后神经功能及细胞凋亡的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物分组 　　清洁级雄性家兔40只，重量750～1 000 g。术前12 h禁食不禁水，随机分为5组，每组8只：①假手术组（S组）；②模型组（M组）；③吡格列酮组（P组）；④GW9662+吡格列酮组（GP组）；⑤DMSO组（D组）。 　　1.2 试剂 　　吡格列酮、GW9662和10%二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司，美国）；原位末端标记（TUNEL）试剂盒（Promega公司）；电子显微镜（Olympus，日本）等。 　　1.3 动物模型制备及处置 　　M组：术前20 min经耳缘静脉注射生理盐水2 mL/kg，采用改良的Zea-longa[3]法制备家兔大脑中动脉阻断（MCAO）模型。缺血120 min后抽出线栓即可造成再灌注模型。模型成功标志：苏醒后出现左侧Horner综合征；爬行时向右侧转圈或跌倒。P组：术前20 min经耳缘静脉注射吡格列酮10 mg/kg。GP组：术前20 min先经耳缘静脉注射GW9662，剂量是0.3 mg/kg[4]，5 min后再经耳缘静脉注射吡格列酮10 mg/kg。D组：术前20 min经耳缘静脉注射10% DMSO 2 mL/kg。S组：术中分离左侧CCA、ICA及ECA，但不做任何缺血处理。 　　1.4 指标检测 　　1.4.1 神经功能评分 再灌注24 h后采用双盲法按Zea-longa 5分法进行神经功能评分，标准如下：①无神经功能缺失症状，计0分；②不能伸展右侧前肢，计1分；③爬行时向右侧转圈，计2分；④身体向右侧倾倒，计3分；⑤不能自发爬行、意识障碍，计4分。 　　1.4.2 HE染色 将各组8只家兔麻醉，以生理盐水进行心脏灌洗，用4℃ 10%多聚甲醛灌洗固定，并迅速断头取脑。距额叶前端3 mm和9 mm处进行冠状分离，取中间6 mm厚的脑组织块，然后沿此脑块矢状缝两侧约2 mm处，从上至下切去两侧半球的正中结构，将左侧脑块作为缺血脑组织，制成蜡块。自前往后连续冠状位切片，厚约5 μm。HE染色光学显微镜下（400×）观察神经细胞形态学变化并采图。 　　1.4.3 TUNEL染色 严格按照试剂盒检测步骤进行操作。TUNEL染色在光镜下（400×）观察凋亡细胞（以胞核出现棕黄染色颗粒代表），计算TUNEL阳性率即TUNEL阳性细胞数占总细胞数的比值并采图。 　　1.5 统计学处理 　　应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。神经功能评分中位数/四分位数法表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用Nemenyi检验。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P 　　3 讨论 　　既往研究表明，脑缺血再灌注时神经细胞可介导大量炎性细胞的聚集和炎性因子的释放[5]，造成神经元凋亡，从而造成对缺血损伤区域细胞的损伤。本研究也发现模型组中细胞凋亡数量相比假手术组显著升高。有研究发现，PPARγ激动剂能活化细胞外信号调节激酶而抑制NF-κB的激活[6]。NF-κB可调控表达许多参与炎症反应、氧化损伤、免疫反应和细胞凋亡等过程的蛋白基因。持续活化在垂死神经元中的NF-κB可诱导细胞凋亡，包括重新进入细胞循环失败和生成死亡蛋白[7]；炎症反应过程中释放一系列细胞因