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穿心莲内酯对白念珠菌生物膜分散影响 　　[摘要]随着真菌感染日渐增多，白念珠菌的防治成为当前抗真菌感染的重点。该研究拟探讨中药单体穿心莲内酯（AG）对白念珠菌生物膜分散的影响。实验以微孔板结合医用导管片构建白念珠菌生物膜模型，分别通过XTT减低法和平板法发现1 000，500，250 mg?L-1AG 能不同程度的影响白念珠菌生物膜分散细胞的活性；以扫描电镜观察导管片残余生物膜形态结构，发现1 000，500，250 mg?L-1AG能剂量依赖性的诱导白念珠菌生物膜的分散，且分散出的细胞以酵母相为主；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测发现AG使HSP90表达上调，使UME6和PES1表达下调。该研究表明AG能一定程度的诱导白念珠菌生物膜分散。 　　[关键词]穿心莲内酯；白念珠菌；生物膜；分散 　　近年来，白念珠菌作为条件致病菌所引起的真菌感染病例日益增多，其致病性与形成生物膜密切相关，而后者是导致其高度耐药性和反复感染的重要原因，生物膜成熟周期包括黏附、形成微菌落、释放胞外多聚物、形成成熟稳定的三维结构及后期生物膜细胞的分散（dispersion）等阶段，而从生物膜上分散下来的细胞易造成菌细胞定植至新的部位，造成感染的播散[1]。 　　穿心莲内酯（andrographolide，AG）是从穿心莲的全草或叶中分离的二萜类化合物，有较显著的抗细菌、真菌和肿瘤效果。本课题组在前期研究中发现，中药单体AG对白念珠菌生物膜形成具有一定的抑制作用，能明显抑制体外白念珠菌的黏附以及介导白念珠菌凋亡[2-4]。为较系统地研究AG对白念珠菌生物膜整个发育周期的影响，故在前期研究基础上考察其对白念珠菌生物膜分散干预的效果。 　　1 材料 　　1.1 菌株 白念珠菌Candida albicans SC5314，由第二军医大学药学院姜远英教授惠赠。 　　1.2 药物与试剂 穿心莲内酯（中国食品药品检定研究院，批号110797-201108）。25%戊二醛溶液（国药集团化学试剂有限公司）；DMSO（博美生物科技有限公司）；XTT（加拿大BBI公司）；维生素K3（美国Alexis公司）；PBS缓冲液（本室配制）；Total RNA提取试剂（日本ToyoBo公司）；PCR试剂（日本ToyoBo公司）。RPMI-1640 液体培养基（pH 7.0±0.1），滤过灭菌，4 ℃保存备用。 　　1.3 仪器 12孔培养板（美国Corning公司）；SpectraMax M2e 多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；血细胞计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）；ABI7000荧光定量PCR仪（美国生物应用系统公司）。 　　2 方法 　　2.1 白念珠菌液和导管片的制备[5] 从4 ℃保存的沙氏培养基上挑取白念珠菌单个菌落，接种于RPMI-1640培养基，于37 ℃培养箱孵育，使白念珠菌处于生长对数期后再次活化，血细胞计数板计数，以RPMI-1640培养基稀释浓度至2×106 CFU?mL-1备用。将医用聚氨酯导管（直径2.4 mm）裁割长为1 cm，75%乙醇过夜除菌，再以胎牛血清浸泡37 ℃过夜，用PBS缓冲液轻洗2次待用。 　　2.2 白念珠菌生物膜分散实验 将白念珠菌浓度用RPMI-1640培养基调整为2×106 CFU?mL-1，导管片放入12孔板，每孔加入2 mL菌液，37 ℃孵育24 h。无菌条件下弃去菌液，取出黏附有生物膜的导管片，以灭菌PBS缓冲液清洗3遍，除去导管片表面未黏附细胞，置于新的12孔板，加入含AG培养基（终浓度为1 000，500，250 mg?L-1）2 mL，氟康唑对照组（FLC，256 mg?L-1），同时设空白对照组，分别培养2，8，12，24 h。 　　2.3 XTT法检测来自生物膜的分散细胞活性 以0.5 g?L-1林格液配制XTT并用0.22 μm孔径过滤器除菌，临用前加入维生素K3（menadione，浓度10 mmol?L-1）。分别于AG作用2，8，12，24 h后，取出导管，充分混匀菌悬液，取100 μL 加入新96孔板，加XTT-维生素K3溶液60 μL，37 ℃避光培养2 h。酶标仪492 nm检测吸光度A。实验重复3次，每浓度设置3复孔，取平均值。 　　2.4 导管片残余生物膜CFU计数 AG作用生物膜2，8，12，24 h后，从12孔板中取出导管片，用PBS缓冲液轻洗导管片2次后，振荡仪涡旋30 s，超声仪4万Hz超声5 min，使生物膜从导管片上脱离下来。将菌悬液按1∶10系列稀释后，取适量均匀涂于沙氏琼脂平皿，37 ℃培养48 h后计数CFU。实验重复3次，取平均值。 　　2.5 扫描电镜检查残余生物膜形态结构 将待检测的导管片标本，以PBS缓冲液轻洗2次，预冷2.5%