虫草素调控eIF2αTGF―βSmad信号通路改善肾间质纤维化机制.docVIP

虫草素调控eIF2αTGF―βSmad信号通路改善肾间质纤维化机制 　　[摘要] 目的：观察冬虫夏草主要有效成分――虫草素（cordycepin）对肾间质纤维化及其eIF2α/TGF-β/Smad信号通路的干预作用和机制。方法：将15只C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组和虫草素组，建立小鼠单侧输尿管结扎（unilateral ureteral obstruction，UUO）肾间质纤维化模型，虫草素组小鼠经皮下注射虫草素（5 mg?kg-1?d-1），同时，以生理盐水干预对照组和模型组，共5 d。实验结束后，取小鼠结扎侧的肾脏，观察肾间质纤维化病理特征，并测定肾组织I型胶原（collagen type I，Col I）和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）核酸表达（Northern blot）；另外，在体外培养大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E细胞），在转化生长因子（transforming growth factor，TGF）- β联合或不联合虫草素干预后，观察I型胶原、IV型胶原（collagen type IV，Col IV）核酸表达的变化（Northern blot），并检测eIF2α、磷酸化eIF2α（phosphorylated eIF2α，p-eIF2α）以及Smad2/3、磷酸化Smad2/3（phosphorylated Smad2/3，p-Smad2/3）蛋白表达的变化（Western blot）。结果：虫草素在体内改善模型鼠肾间质纤维化，包括纤维化的病理特征以及I型胶原、α-SMA核酸的表达；虫草素在体外促进NRK-52E细胞p-eIF2α的高表达，抑制TGF-β诱导的p-Smad2/3以及I型、IV型胶原的表达水平。结论：虫草素在体内有改善肾间质纤维化的作用，它可能是通过诱导eIF2α磷酸化，抑制TGF-β/Smad信号通路中的关键信号分子――p-Smad2/3表达，减少肾组织胶原和α-SMA表达等途径而改善肾间质纤维化。 　　[关键词] 虫草素；肾间质纤维化；eIF2α/TGF-β/Smad信号通路 　　肾间质纤维化是各类慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）发展至终末期肾病的基本环节[1]。目前，冬虫夏草（cordyceps militaris）及其制剂在临床上被广泛应用于治疗各种CKD，而且，对肾脏纤维化有一定的改善作用[2]。研究表明，冬虫夏草制剂可以拮抗5/6肾切除大鼠肾脏纤维化的进展[3]，还可以减少糖尿病大鼠肾组织转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β的产生以及α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、IV型胶原（collagen type IV，Col IV）的表达[4-5]。虫草素（cordycepin）是冬虫夏草的主要有效成分[6]，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化应激、抗衰老等多种功效[7-8]。据报道[9]，虫草素可抑制TGF-β信号及其诱导的α-SMA和纤维连接蛋白（fibronectin，FN）合成。然而，虫草素保护肾损伤的深层作用机制尚未完全阐明。 　　真核翻译起始因子（eukaryotic translation initiation factor，eIF）2α在真核生物核酸翻译起始过程中介导起始转移核糖核酸（trasfer RNA，tRNA）与核糖体的结合，它是核酸翻译的关键调控因子之一。激活eIF2α可抑制eIF2β亚单位活性，影响eIF2-GTP形成，进而引起核酸翻译受阻[10]。据报道，在水貂的肺上皮细胞（Mv1Lu细胞）中，过度表达的eIF2α可以直接抑制TGF-β的应答，干扰其下游相关信号蛋白的合成与表达[11]；笔者既往研究[12]表明，虫草素可促进eIF2α磷酸化。因此，笔者推测，虫草素可能通过活化eIF2α信号，引起翻译抑制，发挥调控Smad信号通路活性的作用。在本课题中，笔者首先在体内观察虫草素对小鼠单侧输尿管结扎术（unilateral ureteral obstruction，UUO）肾间质纤维化模型的干预作用；其次，通过体外实验，观察虫草素对肾小管上皮细胞eIF2α磷酸化及TGF-β/Smad信号通路的影响，最终，揭示其改善肾间质纤维化的可能机制。 　　1 材料 　　1.1 动物 体重约20 g的C57BL/6雄性小鼠（SPF）购自并饲养于日本山梨大学（University of Yamanashi）动物实验中心。所有小鼠均给予标准饮食，并自由饮水。小鼠适应性饲养1周后开始正式实验。 　　1.2 药物与试剂 虫草素购自Sigma-Aldrich公司，重组TGF-β购自RD System公司。抗总eIF2