麦氏比浊法.docVIP

麦氏比浊法制作细菌悬液麦氏比浊管是McFarland发明的一种用于微生物比浊的不同浊度的标准浊度管。具体的配制方法是根据硫酸和氯化钡的比例来定的，有表可查，这样不同比例生成的硫酸钡沉淀的浓度不同，且都有定值。????? 麦氏比浊管的配比如下：?(1.175%w/v BaCL2·2H2O)操作方法：1、轻摇标准试管。2、无菌操作将被测定的肉汤培养物加到与标准管相同直径（大小）的无菌试管中。3、以无菌操作向被测定试管加入无菌生理盐水（NaCl），直到浓度与所要求的标准管的浓度相同。使用技巧：1、直接用眼睛看（需要经验，误差较大）。2、找张白纸，打上平行直线，然后看（如图示，利用光在不同浓度液体折射不同）。注意事项：1、如果测定的肉汤培养物不澄清，由培养物的值减去未接种培养基的值来校正细菌浓度。4号管(肉汤培养物)-1号管(孵育过的未接种的肉汤管)=3号管(校正读数)。2、如果肉汤颜色很深,把未接种试管放在标准管的后面读数即可。编者注：1、测定好的细菌，最好做一下梯度稀释涂布计数。2、此浓度是对应的大肠杆菌的浓度，如果是其他细菌，会有一定的差别，但编者做过的几个菌差别都在一个数量级之内，适合于普通实验。3、此种方法测定的准确性不是很高，如果是对细菌数量要求较精确的，请用紫外分光光度计=================在临床微生物学检验中，麦氏比浊法常用于细菌鉴定、药敏实验前配置菌液时大致判断菌液浓度的一种方法，通常认为，如将配菌液浓度配成0.5麦氏比浊管时，相当于1.5×108细菌数/ml，由于方法本身就是一种估计的方法，所以尽管不同细菌大小差异很大，除了真菌孢子，细菌的差别不大，结果不会有影响。但是，标准比浊管的浓度，是药敏实验结果的影响因素之一。K-B法药敏试验时接种物配制有两种方法，第一种是肉汤增菌法（对数生长法），是用接环挑取3-5个细菌菌落入肉汤增菌管中进行增菌4-6小时，然后用生理盐水或肉汤对增菌管中的培养物进行稀释校正使其浓度达到0.5麦氏比浊标准（因为经过增菌培养其培养物浓度一般都高于此标准）。第二种方法是直接菌落法：从孵育18-24小时的非选择性培养基上，挑取3-5菌落，直接用肉汤或盐制成悬液作为接种，然后将浊度调整至0.5麦氏比浊标准。此法是检测苛养菌（如嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌）和潜在的对甲氧西林耐药的葡萄球菌的推荐方法。 0.5麦氏比浊管配制方法：相当于1.5×108细菌数/ml0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O) 0.5ml0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液混合，置比色管中，放室温暗处保存。用前混匀。有效期为6个月。浊度标准管在625nm处吸光度值为0.08~0.10。应用时，可目测或使用比浊仪即可。要防止麦氏浊度标准管未摇匀或已过期失效。=========麦氏浊度标准（0.5号）（1） 将0.5mL 0.048mol/L的BaCL2 (1.175%w/v BaCL2·2H2O)加到99.5mL 0.18mol/L （0.36N）的H2SO4(1%v/v)中并不断搅动以维持混悬状态。（2） 按每管4-6mL将硫酸钡悬液分装于带悬盖的管子中，管子尺寸应与培养或稀释接种菌所用的管子一致。（3） 这些管子应密封并贮存于室温避光处。（4） 每次使用前，应将浊度标准管置于旋转混匀器上剧烈振动，目测其外观浊度应均匀一致。若有大颗粒出现，此标准管应更换。（5） 使用前核实其正确浓度，每个月都应证实或更换。浊度标准的正确浓度应使用分光光度计测定吸光度核实。该分光光度计光径为1cm，并配有合适的比色杯。0.5号麦氏标准管在625nm处的吸光度值应为0.08-0.10。孢子菌悬液制作方法菌种保藏 将标准菌株分别接种在马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（PDA）斜面上，在 28℃～30℃培养7d～14d 后，在 5℃～10菌种活化 将保藏菌接种在 PDA 斜面培养基试管中，培养 7d～14d，使生成大量孢子。未制备孢子悬液时，不得拔去棉塞。每打开 1 支只供制备 1 次悬液，每次制备孢子悬液必须使用新培养的霉菌孢子。 孢子悬液制备在上述 PDA 斜面培养基中加入少量无菌蒸馏水，用无菌接种环轻轻刮取表面的新鲜霉菌孢子，将孢子悬液置于 250mL 锥形瓶内，然后注入 40mL 洗脱液。 锥形瓶中加入直径 5mm 的玻璃珠 10 粒～15 粒与孢子混合，具塞后置水浴振荡器中不断振荡使成团的孢子散开，然后用单层棉纱布过滤以除去菌丝。将其装入灭菌离心管中，用离心机分离沉淀孢子，去上清液。再加入 40mL 洗脱液，重复离心操作 3次。 用改良察氏液体培养基稀释孢子悬液，用血球计数板计数，制成浓度为(0.8～1.2)×106spores/mL的霉菌孢子悬液。 6 种霉菌均用以上