《药学分子生物学》外源基因表达与基因工程药物.ppt

一、目的DNA的分离获取（分） 二、载体的选择与限制酶切（切） 三、目的DNA与载体连接（连） 四、重组DNA转入受体细胞（转） 五、重组体的筛选与鉴定（筛） 基因克隆五个基本部分 （一）目的基因的获得 1、化学合成 适用于合成分子量较小的目的基因 2、PCR及RT-PCR 合成序列已知的基因 3、基因组文库与cDNA文库 包含全面的基因和mRNA信息 适用于合成分子量较小的目的基因 （100bp以内），如：人生长激素释放因子、血管加压素、干扰素、胸腺素及胰岛素原的基因等。 根据已知某种基因的核苷酸序列或某种基因产物的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的核苷酸短序列，再用DNA合成仪人工合成目的基因。 1、化学合成DNA片段 2、PCR与RT-PCR 扩增 DNA模板 上游引物 下游引物 PCR 扩增 目的片段 mRNA 逆转录 cDNA 上游引物 下游引物 PCR 扩增 目的片段 基因组文库 3、基因组文库与cDNA文库 cDNA文库 3、基因组文库与cDNA文库 基因组文库（genomic library，G-文库） 是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。 cDNA文库（cDNA library，C-文库） 以细胞全部mRNA经逆转录，制备出全套的cDNA克隆集合。 如何从文库中获取目的基因？ 文库查询（screening）： 采用探针与文库中的重组DNA进行杂交反应 文库 重组DNA 探针 杂交信号 电泳后杂交反应检测 基因组文库特点： 含有基因组内全部基因片段（99％），是一个贮存基因组全部序列的信息库（含内含子等）； 真核细胞G-文库中含有较多的重复序列与内含子，一个单拷贝基因只占基因组的10-7～10-5 ； 具有种属特异性，但无组织特异性； cDNA文库特点： cDNA文库中，平均一个目的基因所对应的mRNA占总mRNA的10-4～10-3，相比之下后者比前者在含量上提高2～3个数量级，便于提取目的基因。 体现实时表达的信息，不包含全部遗传信息。 既有种属特异性，又有组织特异性； 载体（vector）：携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。 2. 按功能 克隆载体 表达载体 1. 按来源 质粒 噬菌体 病毒 人工染色体 （二）目的基因与表达载体的重组 病毒 (virus) 质粒 (plasmid) 噬菌体 (phage) 载体按功能分类: 克隆载体（cloning vector） 表达载体（expression vector） 克隆载体基本组成： ① 复制原点； ② 限制酶切位点； ③ 带有筛选标记； 表达载体还具有： ④ 表达调控元件 多克隆位点（multiple cloning sites, MCS）：一段人工合成的DNA序列，含有密集排列的多种限制性内切酶识别序列，以便不同来源的外源DNA片段插入载体。 1. 限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease) 识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的一类核酸内切酶，为原核生物所特有。 分类： Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类 基因工程技术中常用的是Ⅱ类 （分子剪刀），识别与切割位点序列特异，在识别序列内切割 DNA重组 工具酶 限制性核酸内切酶的发现 1970年， 第一个限制性核酸内切酶 定点剪切DNA 操作DNA 1978年， 获诺贝尔生理学或医学奖 限制性核酸内切酶——用于切割DNA 同源重组（Homologous Recombination) 是指发生在非姊妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。 * * * 将某种生物细胞的全部基因组DNA切割成大小合适的片段，并将所有这些片段都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上来讲，这些重组载体上携带该生物的全部基因，称为基因组文库。 利用某种生物的总mRNA经逆转录合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行扩增和保存，称为cDNA文库。 * * 真核细胞G-文库DNA中含有较多的重复序列与内含子（intron），结构基因只占一部分，从中筛选目的基因的 比率小、困难大，且长度长的基因也难以进行完整的 基因克隆。 而C-文库是指从真核细胞中分离纯化出所有mRNA，再以mRNA为模板反转录合成互补的cDNA，如此获得的cDNA片段与适当载体重组、导入宿主细胞，构建出cDNA文库，从中筛选目的基因。 在真核细胞细胞，平均一个目的基因所对应的 mRNA占总mRNA的10-4~10-3，而