转基因技术原理与方法幻灯片课件.pptVIP

柯氏质粒 Cosmid 柯氏质粒可克隆携带40kb大小的DNA片段，并在大肠杆菌中复制保存，综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优点。 柯氏质粒上带有多个单克隆位（RE2），两个cos位点，DNA复制起始位点和抗生素抗性基因，在两个cos位点之间还有一个限制性内切酶位点（RE1）。 2、遗传转化的方法 1、应用于植物转基因技术的方法 2、应用于动物转基因技术的方法 植物遗传转化的方法 （1）间接转化法——农杆菌介导转化法 （2）直接转化法 A、 基因枪转化法 B、 电击法 C、花粉管通道法 D、 PEG介导基因转化法 农杆菌: used extensively for genetic engineering of plants. 包含Ti质粒 Tumor inducing plasmid (bacterial plasmid) T-DNA (Transferred-DNA), 可以转移进入植物基因组. Tumor induced by A. tumefaciens 根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens),是一种革兰氏阴性土壤杆菌,它含有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤.Ti质粒(包括Ri质粒)上有一段转移DNA,在农杆菌侵染宿主植物时,这段DNA可以转移进植物细胞,并稳定地保留在植物细胞染色体中,变为植物细胞新增加的一群基因,最终能通过有性世代遗传给子代 。 Ti Plasmid T-DNA region Left border Right border vir genes ori 已知农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。T-DNA首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞。 auxin 农杆菌与植物细胞相互作用的机制 返回 基因枪转化法由美国Cornell大学的Sanfor (1987)提出,它的主要原理是将包含目的基因的载体包被在微小的金属微粒(钨粒或金粒)表面,通过高压驱动力加速微粒穿透植物细胞壁,导入受体组织细胞内,然后通过组织培养再生出完整的植株.微粒上的外源DNA进入细胞后,整合到染色体上并得到表达,从而实现基因的转化.。 返 回 电击法的主要原理是将原生质体在溶液中与DNA混合,然后利用高压电脉冲作用,使原生质体膜的某些部位被击穿而产生可回复的小孔,外源DNA可通过小孔进入原生质体内,而且不影响经电击处理的原生质体再生植物的能力. 返 回 花粉管通道法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道,直接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞,实现目的基因转化. 返 回 PEG介导基因转化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚-L-鸟核苷酸(pLO)、磷酸钙及高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子.PEG可促使细胞膜与DNA间接触与粘连,并通过引起膜表面电荷的紊乱及干扰细胞间的识别,利于细胞膜间的融合以及外源DNA进入原生质体. 返 回 动物外源基因的导入方法 1）显微注射法 （microinjection） 2）逆转录病毒介导法 3）胚胎干细胞法 4）精子载体法 意大利Lavitrano等1989年首次报道利用精子作为载体获得了转基因小鼠。 5）细胞核移植法 277次乳腺细胞核移植实验；获得29个发育为8细胞的“胚”；13头代孕母亲；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。 6）生殖细胞转染法 基因转移的方法 1.细胞融合 10－6 2.微细胞介导的基因转移 ≤10－6 3.染色体介导的基因转移 10－6 4.脂质体介导的基因转移 ≈2×10－4 5.磷酸钙沉淀物介导的基因转移 10－3－10－7 6.显微注射DNA ≈1－10％ 7.电脉冲介导的基因转移 10～30％ 8.激光，超声波介导的基因转移 10～50％ 9.重组RNA病毒感染 ≈10～100％ 10.重组DNA病毒感染 ≈100％ 3、转基因苗的筛选与鉴定 培养过程中利用标记基因筛选 标记基因 选择标记基因(Slective gene) 报告基因(Report gene) 抗生素类选择基因 抗除草剂类选择基因 生物安全性标记类选择基因 …… β-D-葡萄糖酸苷酶基因(Gus) 荧光素酶基因(Luc) 氯霉素乙酰转移酶基因(Cat) 绿色荧光蛋白基因(Gfp) …… 例 Gus检测 原理：β－Ｄ－葡萄糖酸苷酶基因（Gus），催化β－葡萄糖苷酯类物质水解。其中很多水解产物具有发色团或形成荧光物质。 例：组织化学法测定Gus活性 作用底物为