棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒hasnpvorf99基因的初步研究-preliminary study on hasnpvorf99 gene of helicoverpa armigera nucleocapsid nuclear polyhedrosis virus.docxVIP

棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒（H 棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒（HaSNPV）orf99 基因的研究 I I 摘 要 棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒 (Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus, HaSNPV)是一类双链环状 DNA 病毒，其分子生物学和基因功 能研究已取得很大进展。开放阅读框 99（open reading frame 99, orf99）是 HaSNPV 的一个功能未知的特有基因，本文首次对 HaSNPV G4 株基因组中的 orf99 基因进行 初步实验研究报道。 Orf99 基因和 Ha99 蛋白序列通过生物信息学分析表明：orf99 基因长为 357bp，预计编码 118 个氨基酸，预测蛋白质分子大小为 14．5KDa；orf99 基因起 始密码子上游-62 位和-49 位分别存在早期启动子信号序列“CAGT”和“TATA”； 该基因无信号肽，无跨膜结构；由 SMART 分析该蛋白存在铁蛋白类似结构和氧化 还原酶活性; 通过 PSI-BLAST 比对发现，orf99 仅与美洲棉铃虫 HzSNPV orf102 同源性高达 99%，另外由 PHYLOGENETIC TREE 分析得知 orf99 在 Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus、 Helicoverpa armigera NPV、 Helicoverpa armigera NPV NNg1、Helicoverpa zea SNPV 中比较保守，遗传距离比较近，推 测他们可能是从同一祖先分支进化的。 本试验中，我们用表达载体 pGEX-KG 及表达宿主大肠杆菌 BL21 对 orf99 基因进 行谷胱甘肽（GST）融合表达，表达产物约为 40kDa，与预期的大小相符。 另外,我们成功构建了真核表达载体 pIZ/V5-His-egfp-orf99,该载体利用荧光蛋白 基因 egfp 作为报告基因，将 orf99 和 egfp 连接在 pIZ/V5-His 上，形成融合表达产物 的载体,为进行细胞定位做了准备. 为研究 orf99 基因的功能，我们首先设计一对 200bp 左右，含有 orf99 上下游基 因同源臂，然后以酶切的方法合成可供同源交换的线性片段 Phsp70-egfp-SV40-Cmr，借 助含有 λ 噬菌体 Red 重组系统的质粒 pKD46 及棉铃虫杆状病毒细菌人工染色体 HaBacmid，在大肠杆菌 BW25113 中进行同源重组通过同源重组，在原核水平将该 该基因敲除，构建了 orf99 基因缺失型重组病毒，在此基础上再进行回复,构建回复 型重组病毒，为进一步在昆虫细胞水平研究此基因的功能奠定了基础。 关键词： 棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒；orf99 基因；基因敲除；原核表达； II II Functional Analysis of Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus (HearNPV) G4 orf99 Abstract Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus (HaSNPV) is a kind of large doublestranded cycle DNA virus. Great progress has been made in its molecular and functional research. Open reading frame 99 (orf99) is a special gene, of which function was unknown. This paper tries a tentative report of the functional anaysis of orf99. Bioinformatic anaysis shows that orf99 is 357bp long, which encodes a putative protein, of 118 amino acides with a predicted molecular size of 14．5KDa. The protein was named Ha99. An early baculoviral transcription initation motif “ CAGT ” was found -62nt upstream of the putative translational start site and a