免疫沉淀筛选与双剪接型2.2kbhbv剪接变异体特异性蛋白hbdsp相互作用的肝细胞蛋白-immunoprecipitation screening of hepatocyte proteins interacting with hb dsp, a 2.2 kb splicing variant specific protein of double splicing hbv.docxVIP

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2018-07-27 发布于上海
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免疫沉淀筛选与双剪接型2.2kbhbv剪接变异体特异性蛋白hbdsp相互作用的肝细胞蛋白-immunoprecipitation screening of hepatocyte proteins interacting with hb dsp, a 2.2 kb splicing variant specific protein of double splicing hbv.docx

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免疫沉淀筛选与双剪接型2.2kbhbv剪接变异体特异性蛋白hbdsp相互作用的肝细胞蛋白-immunoprecipitation screening of hepatocyte proteins interacting with hb dsp, a 2.2 kb splicing variant specific protein of double splicing hbv

目录中文摘要…………………………………………………………………………2英文摘要…………………………………………………………………………3正文前言…………………………………………………………………………5第一部分免疫沉淀筛选与HBDSP相互作用的肝细胞蛋白材料和方法……………………………………………………………6结果……………………………………………………………………23小结……………………………………………………………………29第二部分HBDSP与肝细胞蛋白在体内外相互作用的验证材料和方法……………………………………………………………30结果……………………………………………………………………37小结……………………………………………………………………41讨论……………………………………………………………………42结论……………………………………………………………………45参考文献……………………………………………………………………46附录（英文缩略词表、试剂配方及主要仪器设备）……………………51致谢57论文综述乙型肝炎病毒蛋白反式激活功能研究进展58参考文献……………………………………………………………………621免疫沉淀筛选与双剪接型2.2KbHBV剪接变异体特异性蛋白HBDSP相互作用的肝细胞蛋白摘要乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）是一种部分双链环状嗜肝DNA病毒，在医学和公共卫生上具有重要的意义。从世界范围来看，大约有350000000的人感染乙肝病毒，其中亚洲地区占了75%。HBV是慢性肝炎、肝硬化和肝癌的主要致病原因，每年导致1000000人死亡。HBV基因组剪接变异体(splicedvariantsofhepatitisBvirusgenomes)是由3.5Kb前基因组RNA(pregenomicRNA,pgRNA)经剪接后逆转录而成的一类亚基因组DNA。其中长度为2.2kb的HBV剪接变异体占了80%以上，其剪接类型分为单剪接型和双剪接型，对2.2KbHBV剪接变异体的功能研究显示，此类变异体可能导致肝细胞凋亡并与HBV的持续性感染密切相关，但其确切致病机制迄今未明。本研究旨在利用免疫沉淀技术探索能够与双剪接型2.2Kb剪接变异体编码的剪接特异性新蛋白（HepatitisBDoublySplicedProtein,HBDSP）相互作用的肝细胞蛋白，以此深入了解其致病性。本课题第一部分，我们运用免疫沉淀（Immunoprecipitation）及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定（MALDI-TOF-MS）的方法获得了四个与HBDSP相互作用的肝细胞蛋白，分别为：通用转录因子II,i(GeneraltranscriptionfactorIII,GTF2I或TFII-I)、葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulatedprotein,GRP78)、热休克蛋白70(Heatshockprotein70kDa,HSP70)和钾离子通道(Potassiumvoltage-gatedchannel,KVβ.2)。本课题第二部分，首先通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）实验来作验证，结果表明在肝细胞中HBDSP与TFII-I蛋白存在相互作用，而HBDSP与GRP78和KVβ.2没有相互作用。进一步通过GSTpull-down实验证实HBDSP与TFII-I蛋白在体外具有相互作用。TFII-I蛋白是一个多功能转录因子，不仅能够促进染色质重塑，同时在细胞有丝分裂周期中具有重要作用。HBDSP与TFII-I的相互作用，可能影响肝癌细胞的分裂和增殖。本研究为深入探讨HBDSP的致病性奠定基础。关键词：乙型肝炎病毒,RNA剪接,免疫沉淀,通用转录因子II,i2ScreeningforHepatocellularProteinsInteractedwithHepatitisBDoublySplicedProtein(HBDSP)Encodedby2.2KbDoublySplicedVariantofHepatitisBVirusbyImmunoprecipitationAbstractHepatitisBvirus(HBV)isasmallenvelopedhepatotropicviruswithapartiallydouble-strandedDNAgenomeofapproximately3.2kbinlength.Thereareabout350millionpeopleinfectedwithhepatitisBvirusthroughouttheworld,ofwhichAsiaaccountedfor75%.HBVisthemaincauseofchr