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无菌培养系统下的松材线虫消长动态和除菌效果研究 许 刚 指导老师：张建平 生物与环境工程学院 松材线虫病是松树病虫害中最严重的疾病，细菌在松材线虫的致病机制起着重要的作用。为了对这一结果进行研究，我们需要获得大量的无菌松材线虫，但是要获得无菌松材线虫非常困难，导师张建平创制了一种无菌松材线虫的培养装置。 课题的研究背景 这个装置的设计是用木屑+选择性培养基(孟加拉红)，但是这个装置的实验效果还需要优化。我们做这个实验的目的就是对这个装置培养效果做更好的优化，使得优化后的培养基达到产量最高，并且达到无菌的效果。 具体实验方案 1、真菌的培养时间对松材线虫生长数量的影响。 2、松材线虫本身的培养时间对松材线虫带菌状况的影响，如：松材线虫体内是否带菌的研究 3、松材线虫本身的培养时间对松材线虫生长数量的影响 1、真菌的培养时间对松材线虫培养产量的影响 真菌培养时间 2 3 4 5 6 7 平均1 28639 49684 23326 31369 32831 10126 平均2 41562 71010 23326 46534 32831 10126 松材线虫的数量随着松枯稍孢菌的培养时间增加而下降 只是在松枯稍孢菌培养第3天时，松材线虫数量迅速减少的结果与上述趋势有异，可能是实验误差。 2、松材线虫的培养时间对松材线虫带菌数量的影响 松材线虫培养时间 3 5 7 9 11 13 15 17 取样梯度 10-3 10-2 10-2 10-3 10-4 10-4 10-4 10-3 菌落数 2.7 125 156.7 128.7 138 54.3 227.3 125 含菌量 2.7×103 1.25×104 1.567×104 1.287×105 1.38×106 5.43×105 2.273×106 1.25×105 每条松材线虫带菌量（cfu） 2.7 12.5 15.67 128.7 1380 543 2273 125 注：菌落数采用最后一次观察的培养皿中的菌落数的平均值 松材线虫的带菌状况与时间关系是：先逐渐上升，第11-15天之间带菌量趋于稳定状态，然后第17天的带菌量下降。 注：每条松材线虫带菌量（cfu）数据取对数后作图 3、松材线虫体内带菌状况结果 将培养了不同时间的松材线虫研磨后分梯度接入肉汤培养基中，观察肉汤培养基的浑浊情况，得到数据如下，数据表示培养后开始浑浊的天数，11可以判断为不浑浊。 编号 培养 时间 A B C 1 2 3 1 2 3 1 2 3 3 11 6 ﹥11 8 ﹥11 ﹥11 ﹥11 ﹥11 10 5 2 2 2 ﹥11 ﹥11 ﹥11 2 2 2 7 ﹥11 ﹥11 ﹥11 3 3 3 ﹥11 ﹥11 ﹥11 9 1 2 1 ﹥11 ﹥11 ﹥11 ﹥11 ﹥11 ﹥11 11 2 2 2 ﹥11 2 ﹥11 ﹥11 ﹥11 ﹥11 13 2 2 ﹥11 ﹥11 5 ﹥11 ﹥11 ﹥11 4 15 ﹥11 ﹥11 ﹥11 ﹥11 ﹥11 ﹥11 ﹥11 ﹥11 ﹥11 17 ﹥11 ﹥11 ﹥11 ﹥11 ﹥11 ﹥11 10 ﹥11 ﹥11 培养液不混浊表示样品不带菌，即松材线虫体内是不带菌的，松材线虫体表带的菌，在研磨之前通过加双氧水消毒，已经除去了。假如松材线虫体内带菌的话，那么，所有的测量样本最终结果都应该显示浑浊的，可是结果中大部分都是不浑浊的。因此通过这个实验，我们得出结论：用松材线虫无菌培养装置培养的松材线虫体内不带菌，可以获得真正的无菌松材线虫，但仍需要谨慎的除菌操作。需长时间才浑浊的样品可能是由于操作时出现的误差。 4、松材线虫本身的培养时间对松材线虫生长数量的影响 根据松材线虫在木屑中的不同的生长时间，经过分离，对松材线虫的生长数量进行测量、计数。 接种培养时间 5 7 9 11 13 15 17 单个培养装置的松材线虫数量（条） 26041 31520 43192 26687 29353 12280 14341 通过图可以分析出松材线虫不同的培养时间对松材线虫生长状况的影响，虽然略显波动，但是基本趋势还是下降的，其中第9天线虫量为最多，这可能是由于松材线虫无菌培养装置中营养物含量下降造成的。 1、在松材线虫无菌培养装置中，随着培养时间的延长，松材线虫所带细菌越多，但虫体内部都可达到无菌的程度，通过以H2O2消毒处理可获得完全的无菌松材线虫。 2、在松材线虫无菌培养装置中，随着培养时间的延长，松材线虫所带细菌越多，每条松材线虫可达约3－4条，但虫体内部都可达到无菌的程度，通过以H2O2消毒处理可获得完全的无菌松材线虫。 3、在25℃培养温度下，松材线虫培养9天，数量最多。 4、在25℃培养温度下，松材线虫的