禽类多瘤病毒晚期基因表达调控机制的分析-analysis of regulatory mechanism of late gene expression of avian polyoma virus.docxVIP

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2018-07-28 发布于上海
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禽类多瘤病毒晚期基因表达调控机制的分析-analysis of regulatory mechanism of late gene expression of avian polyoma virus.docx

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禽类多瘤病毒晚期基因表达调控机制的分析-analysis of regulatory mechanism of late gene expression of avian polyoma virus

目录摘要1Abstract2第一章绪论11.1病毒概述11.2禽类多瘤病毒研究概况41.2.1禽类多瘤病毒简介41.2.2禽类多瘤病毒的生物学特性51.2.3禽类多瘤病毒的流行病学81.3蛋白质翻译的起始机制91.4本文的研究目的及实际意义101.4.1本文的研究目的101.4.2本文的研究意义11第二章禽类多瘤病毒APV-1的cDNA病毒突变体构建132.1实验材料132.1.1菌种和质粒132.1.2主要试剂142.1.3主要仪器152.2.1SDS碱裂解法制备质粒DNA[47-51]：小量制备152.2.2SDS碱裂解法制备质粒DNA：中量制备162.2.3琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA172.2.4感受态大肠杆菌的制备和转化[52-57]172.2.5酶切APV-1的cDNA病毒突变体pHL1003获取大片段182.2.6获取插入片段192.2.7APV-1的cDNA病毒突变体的构建212.2.8筛选重组质粒212.3实验结果及分析222.4测序结果23第三章禽类多瘤病毒APV-1cDNA病毒晚期基因表达253.1实验材料253.1.1质粒和细胞253.1.2主要试剂253.1.3主要仪器263.2实验方法273.2.1鸡胚成纤维细胞培养273.2.2磷酸钙介导的重组病毒体DNA转染鸡胚成纤维细胞[63-66]283.2.3重组病毒在鸡胚细胞中蛋白表达及检测[67-69]293.3实验结果及讨论323.3.1重组禽类多瘤病毒(APV-1)晚期蛋白表达33参考文献35致谢41附录攻读硕士学位期间发表的学术论文42参与的科研课题42摘要禽类多瘤病毒(Avianpolyomavirus，APV)，早期称鹦鹉幼雏病病毒(BudgerigarFledglingDiseaseVirus，BFDV)。能引起多种鹦鹉雏鸟死亡的急性病毒性传染病。BFDV原属于乳多空病毒科多瘤病毒属。为了研究APV-1晚期基因多顺反子mRNA下游VP1基因的翻译调控机制,含AUG起始码的编码7个氨基酸的具有最佳翻译起始信号的核苷酸被设计插入到agno-1amRNA的上游及AUG起始密码子的人工突变，以观察其对agno-1amRNA下游VP1翻译的影响。本实验针对真核基因多顺反子mRNA的表达翻译的调控机制“Scan-Jumping及InternalRibosomeEntrySite(IRES)”模型，运用现代分子生物学方法在APV晚期基因中设计和构建基因组结构与野生型病毒APV-1相同的具有突变agno-1a区域的新型重组病毒。如片段插入（多重ATG区域叠加）碱裂解法提取APVcDNA克隆pHL1003DNA经AccI部分酶切后回收全长线性目的片段，将合成的agno插入片段磷酸化后与目的片段用T4连接酶连接得到重组质粒,然后验证得到APV-1突变cDNA克隆；点突变（ATG→ACG或CTG，关键蛋白结合位点改变，关键RNA二级结构双链形成部位）pHL1003DNA经AccI部分酶切和NcoI酶切后通过PCR技术将agno-1a区域基因的起始密码子ATG突变为ACG和CTG两种cDNA克隆并经测序验证。分别制备质粒DNA，经磷酸钙法介导单基因和多基因共转染鸡胚成纤维细胞（CEF），利用Westernblot检测重组病毒的基因表达和观察目的蛋白的异同，分析和研究多顺反子mRNA的表达翻译的调控过程。本研究旨在通过研究禽类多瘤病毒（AvianPolyomaVirus，APV）晚期基因多顺反子翻译调控分子机制，了解真核基因多顺反子mRNA表达翻译的复杂过程及其调控机理和建立具复制能力的感染性cDNA的重组病毒及转染和感染鸡胚成纤维细胞系统。由于禽类多瘤病毒能引起幼雏急性致死性疾病和其它鸟类的急性或慢性疾病，为防止禽类多瘤病毒病的大面积传播，减少重大经济损失，有必要在国内不同禽类中进行禽类多瘤病毒感染的流行病学调查，据此开展重点防治并开发安全的基因工程疫苗。该研究可以提供制备基因工程疫苗的理论指导并进行基因工程疫苗初期研制；与家禽养殖场和兽医站联合，建立该病规范化的疫情监测方法和系统。关键词：APV；Scan-Jumping；IRES；cDNA克隆；WesternBlotAbstractAvianpolyomavirus（APV),earlysayBudgerigarFledglingdiseases,（BFDV).Cancauseavarietyofparrotchicksdiedofacuteviralinfections.BFDVbelongingtopapovaviridaepolyomaviruses.InordertostudytheAPV-1polycistronlategenemRNAtranslationofdownstreamVP1genereg