禽多杀性巴氏杆菌c48-3株外膜蛋白h的致病性及其受体的鉴定-pathogenicity of outer membrane protein h of pasteurella multocida c48 - 3 strain and identification of its receptor.docxVIP

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2018-07-28 发布于上海
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禽多杀性巴氏杆菌c48-3株外膜蛋白h的致病性及其受体的鉴定-pathogenicity of outer membrane protein h of pasteurella multocida c48 - 3 strain and identification of its receptor

独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉首大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解吉首大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意吉首大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日目录摘要iABSTRACTii第1章绪论11.1多杀性巴氏杆菌11.2多杀性巴氏杆菌致病因子11.3外膜蛋白OmpH21.4粘附素及其受体31.5研究目的和意义41.6主要研究内容和技术路线5第2章禽多杀性巴氏杆菌C48-3株OmpH的表达、纯化及抗血清制备62.1材料62.1.1质粒和菌株62.1.2实验主要试剂62.1.3实验仪器82.2方法82.2.1C48-3株基因组DNA的提取82.2.2C48-3株ompH基因的PCR扩增92.2.3ompH基因T连接、转化及重组菌筛选92.2.4重组质粒PCR和酶切鉴定92.2.5ompH基因片段测序及序列分析102.2.6重组表达质粒pQE30-ompH的构建102.2.7目的蛋白的诱导表达及其纯化102.2.8重组蛋白rOmpH抗体的制备102.2.9重组蛋白rOmpH的免疫原性检测102.3结果及分析112.3.1基因组DNA的琼脂糖电泳检测112.3.2PCR产物的琼脂糖电泳检测112.3.3菌落PCR鉴定122.3.4重组质粒的鉴定122.3.5重组蛋白rOmpH表达和纯化132.3.6重组蛋白rOmpH的免疫原性检测142.4讨论14第I页第3章禽多杀性巴氏杆菌C48-3株OmpH的致病性163.1材料163.1.1菌株和材料163.1.2实验试剂163.1.3主要仪器173.2方法183.2.1鸡胚成纤维细胞培养183.2.2粘附试验183.2.3粘附抑制试验193.2.4血清敏感性试验193.2.5吞噬试验193.3结果与分析203.3.1粘附试验203.3.2粘附抑制试验213.3.3血清敏感性试验223.3.4吞噬试验223.4讨论23第4章禽多杀性巴氏杆菌C48-3株OmpH受体的分离和鉴定254.1材料254.1.1实验材料254.1.2实验试剂254.1.3实验仪器264.1.4实验主要缓冲液274.2方法274.2.1鸡胚成纤维细胞的制备274.2.2鸡胚成纤维细胞的观察及收集284.2.3鸡胚成纤维细胞膜蛋白的制备28rOmpH结合膜蛋白的Ligandblot试验28受体蛋白的MALDI-TOF鉴定294.2.6rOmpH结合鸡胚成纤维细胞的间接免疫荧光检测294.2.7不同宿主粘膜细胞膜蛋白的制备及Ligandblot检测294.2.8rOmpH结合不同宿主粘膜膜蛋白的间接ELISA检测294.2.9rOmpH结合不同宿主粘膜膜蛋白的免疫荧光检测294.3结果及分析304.3.1鸡胚成纤维细胞30第II页4.3.2鸡胚成纤维细胞膜蛋白的SDS检测30rOmpH结合膜蛋白的Ligandblot检测31受体蛋白的MALDI-TOF鉴定324.3.5rOmpH结合鸡胚成纤维细胞的间接免疫荧光检测324.3.6检测rOmpH结合不同宿主食管粘膜膜蛋白334.4讨论35结束语36致谢38参考文献39作者在学期间取得的学术成果44第III页表目录表2.1常规实验试剂6表2.2主要实验仪器8表3.1常规实验试剂17表3.2主要实验仪器18表4.1常规实验试剂25表4.2主要实验仪器27第I页图目录图1.1研究技术路线5图2.1基因组DNA琼脂糖凝胶电泳11图2.2C48-3株ompH基因的PCR扩增12图2.3重组菌的菌落PCR扩增12图2.4PCR和双酶切鉴定重组质粒13图2.5表达和纯化的重组蛋白的SDS检测13图2.6重组OmpH蛋白的Western印迹检测14图3.1细菌粘附鸡胚成纤维细胞20图3.2不同菌株对鸡胚成纤维细胞的粘附率21图3.3粘附抑制试验21图3.4血清敏感性试验22图3.5吞噬试验23图4.1鸡胚成纤维细胞30图4.2膜蛋白SDS检测31图4.3rOmpH结合膜蛋白的Ligandblot检测31图4.4膜蛋白MALDI-TOF质谱鉴定32图4.5rOmpH结合鸡胚成纤维细胞免疫荧光检测32图4.6rOmpH结合不同宿主膜蛋白的Ligandblot检测33图4.