乳腺癌中过表达bag-1基因与er表达相关性的研究-correlation between overexpression of bag - 1 gene and er expression in breast cancer.docxVIP

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2018-07-29 发布于上海
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乳腺癌中过表达bag-1基因与er表达相关性的研究-correlation between overexpression of bag - 1 gene and er expression in breast cancer.docx

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乳腺癌中过表达bag-1基因与er表达相关性的研究-correlation between overexpression of bag - 1 gene and er expression in breast cancer

学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。本论文属于保密，在年解密后适用本授权书。不保密。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日中文摘要目的：雌激素受体(estrogenreceptor,ER)、孕激素受体(progesteronereceptor,PR)和人类表皮生长因子受体-2（Humanepidermalgrowthfactorreceptor-2,HER-2）表达水平与内分泌治疗、靶向治疗密切相关，是乳腺癌患者预后的重要指标。他莫昔芬作为内分泌治疗的代表药物分别被广泛用于ER和/或PR阳性的患者，然而内分泌耐药的出现给乳腺癌患者的治疗增加了困难，且目前对与ER相关的基因知之甚少；BAG-1是一种可显著促进Bcl-2抗凋亡作用的抗凋亡基因，由Takayama等在寻找Bcl-2蛋白和活化的糖皮质激素受体的结合蛋白时发现，有研究报道BAG-1可增强ER表达，并且BAG-1影响ER阳性乳腺癌患者的预后；我们前期的研究也发现在ER阳性乳腺癌患者中BAG-1高表达，且有统计学意义，现本研究通过过表达BAG-1（Bcl-2associatedathanogene-1）基因检测ER表达变化以及人乳腺癌细胞系对内分泌药物的敏感性变化，期望发现与内分泌治疗相关的新靶点。方法：选取ER(+)的人乳腺癌细胞系T47D及ER(-)的人乳腺癌细胞系SK-BR-3，采用real-timePCR技术检测BAG-1、ER在mRNA水平的表达，用Westernblotting技术检测其在蛋白水平表达；选用BAG-1上调重组质粒转染T47D细胞，48h后用Westernblotting及Real-timePCR技术检测BAG-1表达变化；并用MTT分别检测BAG-1表达上调组及空质粒组乳腺癌细胞在不同他莫昔芬药物浓度下的存活率，FACS检测细胞转染空质粒、上调质粒后在他莫昔芬药物作用下的凋亡率和细胞周期变化，Westernblotting及Real-timePCR技术分别检测ER在蛋白质和mRNA水平的变化，Co-IP检测BAG-1与ER之间关系。结果：1、Westernblotting检测SK-BR-3及T47D乳腺癌细胞中均有BAG-1表达，且T47D细胞系中表达高于SK-BR-3细胞系；Westernblotting未检测到SK-BR-3细胞系中ER表达，在T47D细胞系中检测到ER表达。Real-timePCR实验发现T47D细胞系中BAG-1及ER表达水平均高于SK-BR-3细胞系。为进一步研究BAG-1基因与ER的关系，我们选择了BAG-1、ER均有I表达的T47D细胞系继续下一步试验。2、Realtime-PCR证实转染入BAG-1重组质粒的T47D细胞BAG-1表达量较空质粒转染组升高(P0.05),Westernblotting发现转染入BAG-1质粒组的T47D细胞BAG-1蛋白表达量较空质粒转染组显著升高。3、Westernblotting发现转染入BAG-1重组质粒组的T47D细胞ER蛋白表达量较空质粒转染组升高,Real-timePCR实验发现，转染入BAG-1重组质粒的T47D细胞，ER在mRNA水平显著升高。4、MTT结果发现转染空质粒和BAG-1重组质粒后，ER（+）乳腺癌细胞均随4-OHTAM药物浓度增加细胞存活率降低，在相同药物浓度作用下，转染过表达质粒的乳腺癌细胞较转染空质粒的乳腺癌细胞对4-OHTAM药物敏感性增加，且在药物浓度为14μmol/ml时，差异有统计学意义（p＜0.05）；用14μmol/ml浓度的药物处理48小时后，流式细胞术检测细胞凋亡发现，BAG-1重组质粒组的凋亡率较转染空质粒对照组增多（7.700±1.69706%vs.5.55±0.77782%），经统计学分析差异显著（p＜0.01），流式细胞术检测细胞周期发现BAG-1重组质粒组细胞阻滞于G0/G1期较转染空质粒对照组增多（69.1850±0.70004vs.64.385±0.12021），经统计学分析差异显著（p＜0.01）。5、免疫共沉淀实验未发现BAG-1蛋白与ER表达存在