三氧化二砷联合维生素c对耐药性肺癌作用及机制的分析-effect and mechanism of arsenic trioxide combined with vitamin c on drug-resistant lung cancer.docxVIP

三氧化二砷联合维生素C对耐药性肺癌作用及机制的研究中文摘要目的：探讨三氧化二砷（As2O3）联合维生素C（VitC）对耐药性肺癌A549/R细胞及其移植瘤增殖、凋亡的影响，进一步探讨As2O3联合VitC对耐药性肺癌增殖、凋亡、侵袭影响的可能机制。方法：1.在体外培养肺癌耐药细胞株A549/R，加入不同浓度的As2O3及AS2O3联合VitC用药后，采用细胞增殖测定检测药物对细胞生长的影响；采用克隆形成实验检测药物对细胞成瘤性的影响；及采用流式细胞术检测用药24小时后细胞周期及凋亡率。2.建立耐顺铂肺癌裸鼠移植瘤模型，腹腔注射不同浓度As2O3及As2O3联合VitC2周，绘制各组肿瘤生长曲线，计算抑瘤率。3.剥离裸鼠肿瘤行苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察并拍照评价移植瘤的病理变化；免疫组织化学染色检测肿瘤组织Survivin、Caspase-3蛋白表达情况。4.提取裸鼠移植瘤总RNA及蛋白，RT-PCR检测Survivin、Caspase-3、VEGFmRNA的表达，Westernblot检测Survivin、Caspase-3、VEGF蛋白的表达。结果1.生长曲线：分别以0.04μg/ml、0.4μg/ml、4μg/ml、40μg/ml的As2O3(分别是1/100临床用药量、1/10倍临床用药量、1倍临床用药量、10倍临床用药量）)作用于耐药性肺癌A549/R细胞，绘制生长曲线，发现0.04μg/ml、0.4μg/mlAs2O3对A549/R增殖的影响不明显，而4μg/ml、40μg/mlAs2O3对A549/R细胞的增殖有明显抑制作用。以0.04μg/mlAs2O3、400μg/mlVitC（临床治疗用药量）及0.04μg/mlAs2O3联合400μg/ml的VitC作用于A549/R细胞，绘制生长曲线发现联合用药组的抑瘤率最显著，与单用0.04μg/mlAs2O3、400μg/mlVitC有显著性差异，与单用4μg/mlAs2O3无明显差别。2.克隆形成实验：0.04μg/mlAs2O3联合400μg/mlVitC组细胞集落数最少，与单用0.04μg/mlAs2O3、400ug/mlVitC组相比有显著差异。3.流式细胞术检测：0.04μg/mlAs2O3组及As2O3联用VitC组把A549/R细胞阻滞在G0/G1期，明显延长A549/R的细胞周期，且As2O3联用VitC组明显协同增加细胞的凋亡。4.肿瘤生长曲线及抑瘤率：3mg/kgAs2O3能有效抑制肿瘤的生长，1.5mg/kgAs2O3联合VitC组抑制作用更加明显，与单用1.5mg/kgAs2O3及VitC组有显著性差异。5.病理学及免疫组织化学染色检查：3mg/kgAs2O3能使肿瘤组织坏死，凋亡增加，1.5mg/kgAs2O3联合VitC组较单用3mg/kgAs2O3更为明显。3mg/kgAs2O3及联合用药组组织细胞中Caspase-3蛋白阳性率增高，Survivin蛋白阳性率减低。6.RT-PCR检测：3mg/kgAs2O3组及1.5mg/kgAs2O3联合VitC组可以上调Caspase-3mRNA的表达；下调SurvivinmRNA、VEGFmRNA的表达，联合组与其他组相比有明显的差异。7.Westernblot检测：3mg/kgAs2O3组及1.5mg/kgAs2O3联合VitC组可以上调Caspase-3蛋白的表达；下调Survivin蛋白、VEGF蛋白的表达，联合组与其他组有明显的差异。结论本实验证明As2O3联合VitC可以明显协同抑制耐药性肺癌细胞及移植瘤的增殖、侵润并且协同促进其凋亡，并能在保证疗效的情况下减少As2O3的用药量。其协同机制可能是将细胞阻滞在G0/G1期，延长细胞周期，并有效抑制Survivin、VEGF及上调Caspase-3的表达促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成。关键词：三氧化二砷；耐药性肺癌；维生素C；细胞凋亡；Caspase-3；Survivin；VEGFStudyonAntitumorEffectsofAs2O3combinedwithVitaminConresistanthumanlungcancerABSTRACTObjective：Tostudytheeffectofarsenictrioxide(As2O3),AS2O3withVitaminCondrugresistantlungcarcinomacellA549（A549/Rcell）andthesubcutaneouslytransplantedtumorofdrugresistanthumanlungtumorsinnudemice.Furtherexploretheunderlyingmechanismandsynergy,andp