神经干细胞移植治疗脑出血的实验分析-experimental analysis of neural stem cell transplantation in treating cerebral hemorrhage.docxVIP

贵阳医学院 贵阳医学院 2014 届硕士研究生论文 万方数据 万方数据 神经生长抑制因子[7]。随着干细胞研究的发展，人们尝试用向脑的损伤部位移植 神经干细胞的方法来克服神经元丢失的问题。证实了神经干细胞在一定程度上有 利于中枢神经系统损伤的修复。 3 1.材料 1.1 动物 材料与方法 健康 6 月龄，体重 200-300g 孕 14 天 SD 大鼠(由贵阳医学院实验动物中心提 供),合格证编号[SYXK（黔）2013-0032]）。 1.2 材料 改良的 Eagle 培养基、DMEM／F12、1％N2、2％B27(购自 Gibco 公司)；bFGF、 EGF、小鼠抗 Nestin 单克隆抗体、兔抗 NeuN 单克隆抗体、小鼠抗 Gal-c 单克隆 抗体、兔抗 Neuregulin1 多克隆抗体(Chemicon 公司)；二抗为 594Cy3 标记的驴 抗小鼠 IgG(Jackson 公司 ) 和 Cy3 标 记 的 驴 抗 兔 IgG(Jackson 公司 ) ； Hoechst33258(Molecular Probs 公司)。 1.3 器材 垂直层流洁净台(CA.920.3，上海上净净化设备有限公司)、解剖显微镜(Nikon 公司)、CO2 恒温培养箱(Pression Scientific 公司)、高速低温离心机(Thermo IEC 公司)、IX71 倒置相差显微镜(Olympus 公司)、电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9053A 型)、96 孔细胞培养板，细胞计数板(Nunclon 公司)。常规手术器械，显微手术器 械，培养皿，玻璃培养瓶(50mi)，各种规格的培养板(BIOFIL 公司)，400 目不锈 钢筛网，各种规格的吸管及巴士德吸管，酒精灯。 2.实验方法 2.1NSCs 细胞原代分离 ①无菌条件下，取新生大鼠端脑； ②用 PBS 冲洗 3 次，去除硬膜和血块； ③用眼科剪剪碎组织块，加入胰酶 37℃消化 30min； ④去除消化管，用滴管反复吹打至单细胞悬液； ⑤单细胞悬液过 200 目滤网； ⑥1000r/min 离心，弃上清； ⑦加入完全培养基重悬细胞沉淀，接种至 25cm2flask，放置在 37℃、5%CO2 培养箱中培养。 2.2 细胞培养及传代 4 NSCs 细胞用含 10%（V/V）胎牛血清的 DEME 培养液于 37℃、5%CO2、 饱和湿度的环境中培养，倒置显微镜观察细胞生长形态，隔日换液，细胞生长至 80%融合状态时（约 3-4 天）经 0.25%胰酶消化进行传代：吸出旧培养液，用 PBS 洗涤细胞两次，加入 0.5ml 0.25% 胰蛋白酶 0.02% EDTA 消化液，在 37℃消化 1min 后，在倒置显微镜下观察细胞变化，当细胞回缩、细胞间隙增大时，立即 加入 1ml 含 10% FBS 的 DMEM 培养基终止消化。用玻璃吸管吸取瓶内液体，按 顺序从培养瓶底部一侧到另一侧反复吹打瓶底细胞，使细胞脱离瓶壁形成细胞悬 液，吹打时动作要轻柔。将细胞悬液转移入离心管，1000rpm，离心 5min，弃上 清，加入适量培养基重新悬浮细胞，血球计数板计数后以每瓶 2×105 个细胞接种 入新的培养瓶中，每瓶加入培养液 5-6ml，置于 37℃，5%CO2 培养箱内培养。 2.3 GFP 标记 NSCs 使用脂质体 2000（ lipofectamine 2000）将携带绿色荧光蛋白（GFP，Green fluorescent protein）的质粒转染神经干细胞细胞，其具体步骤：转染前一天，以 合适的细胞密度接种到 6 孔培养板上。转染时，细胞要达到 90-95%的融合。溶 液 1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积 250 ul） （温育 5min）溶液 2 ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积 250 ul）将 溶液 1 与溶液 2 混合，室温下置 20min。与此同时，将 6 孔板中的细胞用无血清 培养基冲洗细胞两遍后，加入 2ml 无血清培养基。将溶液 1 与溶液 2 的混合液 逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在 37℃，5％的 CO2 中保温 5-6 小时。 6 小时后，更换含有血清的全培养基，在 37℃，5％的 CO2 中 48-72h 通过荧光显 微镜观察。 2.4 细胞形态学观察 在普通培养板上的第 l、3、7 天 NSCs-GFP 用荧光显微镜 488nm 激发波长、 530nm 发射波长下观察生长情况。 NSCs 鉴定 取第 3 代 GFP 标记的 NSCs 细胞球，将其放人含有经多聚赖氨酸处理的盖 玻片的 6 孔板，加入无 bFGF 和 EGF 的神经