水稻条纹病毒rsvrna3 rna4的克隆与抗rsv转基因水稻的培育-cloning of rice stripe virus rsv rna 3 rna 4 and cultivation of transgenic rice resistant to rsv.docx

中文摘要水稻条纹叶枯病（Ricestripedisease）是水稻上普遍发生、危害严重的一种病毒病，其病原为水稻条纹病毒（Ricestripevirus,RSV）。近年来，随着种植方式的改变，耕作栽培技术的变化，导致水稻条纹叶枯病在黄淮稻区迅速回升，1999年后暴发成灾，目前已成为该稻区水稻生产上最主要的病害。水稻感染RSV后，造成水稻心叶褪绿，捻转，并弧圈装下垂，严重的心叶枯死，导致水稻产量大幅降低，甚至绝产。RSV主要由介体灰飞虱持久性经卵传播，电镜下观察病毒粒子呈丝状粒体，以折叠、分枝和超螺旋等形式存在。RNA介导的病毒抗性（RNA-MediatedVirusResistance,RMVR）是近年来发展起来的一种新的抗病毒基因工程策略，其通过对入侵的病毒RNA进行降解，使入侵的病毒不能在植物中积累，从而赋予转基因植物病毒抗性。本研究探求了RSV致病性增强的分子机理，并培育了高抗且稳定遗传到T2代的抗水稻条纹病毒的转基因水稻，对于提高水稻的产量，保护水稻生产的可持续发展，具有重大意义。研究结果和主要结论如下：（1）水稻条纹病毒山东济宁分离物的分子变异分析传统的生物学测定发现RSV不同分离物之间存在着化学组成和致病性上的差异。近些年的研究表明，这种差异同样表现在核苷酸的水平。通过对部分分离物的RNA3、RNA4或部分编码基因的序列分析发现，RSV的基因序列和5′端及3′端非编码区序列相当保守，变异主要发生在基因间隔区(IR)，但目前尚缺乏对不同类型病毒种群的遗传变异的系统分析。从山东济宁感病的水稻上，分离到强致病性水稻条纹病毒，命名为RSV-SD-JN2。为了从分子水平探讨RSV-SD-JN2变异及其致病性增强的原因，采用RT-PCR技术，克隆RSV-SD-JN2的RNA3、RNA4区段cDNA。序列测定结果显示，RSV-SD-JN2的RNA3和RNA4核苷酸序列长度分别为2487bp、2157bp；RNA3中，NS3基因长为636bp，IR为725bp，CP基因为969bp；RNA4中，SP基因长为537bp，IR为654bp，NSvc4基因为861bp。将RSV-SD-JN2与不同时期、不同区域和不同致病性的辽宁盘锦PJ、北京双桥SQ、江苏洪泽HZ、云南昆明KM、山东济宁SD-JN1，江苏江阴JY、浙江ZHEJIANG分离物的RNA3、RNA4全序列或部分序列进行比较分析，发现RNA3、RNA4序列5′和3′末端非编码区具有高度保守，仅存在个别碱基的差异；基因编码区保守性较高，核苷酸序列同源性均在93％以上，氨基酸序列同源性高达97％以上，且大部分碱基变异为无意义变异；IR易于变异，IR4的核苷酸序列同源性仅在91.6%-94.3%之间，而IR3的同源性为85.8%-96.7%。IR的变异导致RNA二级结构－发夹结构的稳定性提高是病毒致病性增强的重要原因。同时发现，SD-JN2分离物的RNA3内部各个序列可能存在不同的亲缘关系；NS3基因和CP基因与HZ分离物有很高的同源性，分别为98.9%和99.1%；而IR仅为86.3%，推测是由不同亚群的分离物的基因组相应片段经过交换重配引起的。（2）抗RSV两种分离物转基因水稻新种质的培育目前，种植抗条纹叶枯病品种是防治RSV最根本、有效的方法。而粳稻是黄淮稻区主要的种植品种，由于粳稻中缺少抗条纹叶枯病基因，病害的流行和发生已经给水稻生产造成重大损失。常规的培育水稻抗病品种的方法周期长、效率低。RNA介导病毒抗性是目前培育抗病毒作物最为有效而且快捷的方式，其具有抗性表型近乎免疫、抗性持久、生物安全性高等特点，是一种具有实际应用价值的植物抗病毒基因工程策略。但是RNA介导的病毒抗性还具有抗病性谱窄的缺点。为了克服这种缺点，可以通过构建包含同一病毒不同基因的嵌合基因片段的表达载体，导入植物，既可以提高抗性水平，又能增强对同一病毒不同分离物抗性范围及抗性遗传的稳定性。本研究基于RNAi的原理，同时为了克服因病毒突变造成的抗性逃逸，培育了高抗、广谱并且稳定遗传的转基因水稻。首先改造了pCAMBIA1300表达载体，加入了玉米泛素蛋白基因Ubi启动子，胭脂碱合成酶基因3′端Nos终止子，将选择标记基因HygromycinB替换为生物安全性更高的Bar基因，构建了新的表达载体pUNB。利用RSV-SD-JN2的CP、SP基因部分片度构建了包含CP/SP嵌合基因及单CP、单SP基因的RNAi载体p1300CP/SPp1300CP、p1300SP；冻融法导入农杆菌EHA105，利用农杆菌介导的转化方法，转化水稻豫粳6号愈伤组织，分别获得了T0代转基因植株23、24和17棵。自交结实获得T1代株系，每个载体的T1代转基因株系各选取100棵，用来自山东济宁和江苏淮安RSV分离物接种，病毒抗性的检测结