筛选与cvb3 vp3蛋白相互作用的人细胞蛋白-screening of human cell proteins interacting with cv b3 vp3 protein.docx

摘要目的：从人心脏cDNA文库中筛选出与CVB3VP3蛋白相互作用的人细胞蛋白。方法：I.采用PCR技术扩增出VP3基因，将其插入到真核表达质粒pGBKT7中构建重组诱饵质粒pGBKT7-VP3；2.采用乙酸锂法将pGBKT7-VP3转化至酵母菌AHI09中，通过表型鉴定、PCR法验证质粒pGBKT7-VP3是否转化至酵母菌中；3.利用Westernblot检测酵母菌AHI09[pGBKT7-VP3]中VP3蛋白的表达；4.利用营养缺陷培养基以及酶底物X-a-Gal的变化情况检测VP3基因对报告基因（HIS3、ADE2和MELI）的转录自激活作用；5.经小规模配合试验检测VP3蛋白对酵母菌配合功能的影响；6.利用大规模酵母配合实验筛选人心脏cDNA文库；7.经阳性克隆的表型确定、PCR扩增cDNA插入片段和AluI酶切等试验将阳性克隆归类，并进行测序和同源性比对分析；8.采用a-半乳糖苷酶定量分析VP3蛋白与各阳性蛋白之间相互作用的强弱；9.利用营养缺陷培养基以及酶底物X-a-Gal的变化情况检测阳性文库质粒pGADT7-ADx对报告基因（HIS3、ADE2和MELI）的转录自激活作用；I0.利用回返配合试验对筛出的各阳性蛋白与VP3蛋白的相互作用再次进行验证。结果：I.双酶切及序列分析提示VP3基因已成功插入pGBKT7载体的多克隆位点，并且阅读框与病毒VP3基因一致；2.表型鉴定和PCR法验证pGBKT7-VP3质粒已成功转入酵母菌AHI09中；Westernblot证实酵母菌AHI09[pGBKT7-VP3]能表达VP3蛋白；4.营养缺陷型培养基和酶底物X-a-Gal变化情况显示VP3蛋白对报告基因II无转录自激活作用；5.小规模配合试验表明VP3蛋白在AHI09的表达基本不影响酵母菌正常的配合功能。6.以CVB3VP3为诱饵蛋白，从人心脏cDNA文库中筛选到50个阳性候选克隆；7.经阳性候选克隆的初步分析将阳性克隆归为I0类，并经测序和同源性比对，最后共获得I0种不同类别的阳性蛋白：线粒体乙醛脱氢酶2（ALDH2）、内质网-高尔基体中间室蛋白I（ERGICI）、真核翻译起始因子4A2（EIF4A2）、肌钙蛋白I3型（TNNI3）、平滑肌蛋白3（LMOD3）、羟酰辅酶A脱氢酶三官能蛋白转录变体3（HADHB）、门冬酰胺酶同系物（ASPG）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、肌肉型肌酸激酶（CKM）、骨骼肌aI肌动蛋白(ACTAI)。8.a-半乳糖苷酶定量试验进一步证明了筛选出的I0种阳性蛋白与VP3蛋白均有较强的相互作用；9.筛选出的I0种阳性蛋白对报告基因无转录自激活作用；I0.回返配合试验再次验证I0种阳性蛋白与VP3蛋白存在相互作用。结论：I.成功构建了重组质粒pGBKT7-VP3；2.CVB3VP3蛋白是一个适合用于酵母双杂交系统的诱饵蛋白；3.以CVB3VP3为诱饵蛋白，应用大规模酵母配合实验，从人心脏cDNA文库中获得I0种与VP3蛋白发生相互作用的人细胞蛋白：ALDH2、ERGICI、EIF4A2、TNNI3、GAPDH、LMOD3、HADHB、ASPG、CKM、ACTAI；关键词：柯萨奇病毒；VP3；质粒构建；酵母双杂交系统国家自然科学基金资助项目（No.8II60I96）国家自然科学基金资助项目（No.306600I0)江西省教育厅科学技术研究项目（No.GJJI2I60）江西省江西省研究生创新专项资金项目（No.YC20I2-S020）IIIABSTRACTObjective:ToscreenthehumancellproteinsfromthecDNAlibraryofhumanheart，thatinteractwithCVB3VP3protein.Methods:TheVP3genewasamplifiedbyPCR.PCRproductofVP3wasinsertedintovectorpGBKT7，thentherecombinantbaitplasmidpGBKT7-VP3wasobtained.UsingtheLiAc-mediatedmethod，theplasmidpGBKT7-VP3wastransformedintoyeaststrainAHI09，thenphenotypeidentificationandPCRwereappliedtoconfirmwhethertheplasmidpGBKT7-VP3wastransformedintoyeaststrainAHI09.ExpressionofVP3proteinyeaststrainAHI09wasdetectedbyWesternblotting.VP3proteinforauto-transcriptionalact