实时可视化pma-lamp方法检测三种食源性微生物活菌方法研究-study on the method of real-time visualization pma - lamp to detect three kinds of food-borne microorganisms.docx

Study on the real-time visual PMA-LAMP method for detection of three foodborne pathogens By Yingying Wu A Dissertation Submitted to China Jiliang University In partial fulfillment of the requirement for the degree of Master of Science China Jiliang University June, 2015 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取 得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 中国计量学院 或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 中国计量学院 有关保留、使用学位论文 的规定。特授权 中国计量学院 可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供 查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 （保密的学位论文在解密后适用本授权说明） 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日 项目基金支持 本论文受浙江省自然科学基金项目（LY13C200009）资助完成。 致 谢 本文是在导师张明洲教授的悉心指导下完成的。值此论文完稿之际，谨向 张老师致以崇高的敬意和衷心的感谢，感谢张老师在我硕士学习阶段对我学习、 生活上所给予的无限关怀和指导，并祝福老师身体健康、万事如意。 张老师渊博的学识、过人的胆识、严谨的态度和创新的精神永远值得我不 断地学习。在求学期间，张老师不仅为我创造了优越的科研和学习条件，在专 业知识方面给予了悉心的指导，同时在思想修养、人生态度和意志品质方面的 谆谆教诲、循循善诱也令我终身难忘，这些教益必将是我以后人生中的一笔宝 贵财富，鼓舞我在人生道路上勇往前行。 另外，也要特别感谢师兄师姐方结红、奚茜、李庆超、龚云飞与浙江迪恩 生物科技股份有限公司研发中心张弛，在实验技巧和论文撰写上给了我很大的 帮助。谢谢戴明雁、吴俊清在生活和学习上给我的关心帮助，还有很多老师和 同学给我的帮助，是你们让我的三年研究生生涯变得更加充实，在此不做一一 描述，一并向他们致以诚挚的谢意和衷心的祝福。 感谢我最亲爱的家人，你们无保留的支持和爱让我勇往直前！ HYPERLINK /wmgxx 最后，衷心地感谢为评阅本论文而付出宝贵时间和辛勤劳动的专家们，你 们的意见令本论文更加完美，谢谢大家！ 吴莹莹 2015 年 6 月 实时可视化 PMA-LAMP 方法检测三种 食源性微生物活菌方法研究 摘要：当今社会，由食源性致病菌引起的食物中毒情况依旧十分严峻，对全世 界尤其是发展中国家的食品卫生安全造成巨大的威胁。在世界范围内，沙门氏 菌和副溶血性弧菌是最为常见的两种引起食物中毒的致病菌，而霍乱弧菌则时 常引起霍乱的暴发流行，严重威胁着人们的生命财产安全。因此，建立相应的 快速检测手段至关重要。目前，各类免疫、分子相关的快速检测技术逐渐趋于 完善和成熟，但它们普遍存在需要专业人员、价格昂贵等缺点，并且不能区分 食品中存在的活菌与死菌，这势必加大检测结果假阳性的可能性，造成不必要 的恐慌和资源浪费。针对上述难题，本论文建立可视化 PMA-LAMP 快速检测 技术来检测这三种食源性致病菌活菌，一方面解决 LAMP 技术存在的两个方法 学基础问题，一方面为食品安全的诊断防治提供新思路和技术平支持。 本研究根据霍乱弧菌 thyA 基因（GenBank 登录号：AY143429.1）、副溶血 性弧菌 toxR 基因（GenBank 登录号：GQ228073.1）、沙门氏菌 invA 基因（GenBank 登录号：M90846.1）、沙门氏菌 fimY 基因（GenBank 登录号：JQ665438.1）的 相关序列，分别设计 LAMP 和荧光定量 PCR 引物，并构建标准质粒。经过优化， 确定可视化 LAMP 反应的体系如下：20 mM Tris-HCl （pH 8.8），10 mM KCl， 8 mM MgSO4，10 mM (NH4)2SO4，0.1% Tween 20，0.8 M 甜菜碱（Betaine）， dNTPs 各 1.4 mM，0.4 μM F3/B3，3.2 μM FIP/BIP，1.6 μM LF/LB，0