式根岛海绵宏基因组文库活性物质分析-analysis of active substances in spongebob metagenomic library of fanggendao island.docx

摘要海绵是次级活性代谢产物的丰富和重要来源。很多海绵次级代谢产物是由海绵的共生菌产生的。但是，大多数的海绵微生物在实验条件下仍然无法培养。功能宏基因组学可以不经过任何培养或分离步骤，直接从环境样品中提取基因组DNA，来开发未培养环境微生物。由于海绵微生物具有化学和生物多样性，海绵宏基因组文库将是一种很有潜能的资源，可用来探索独特的活性小分子物质及其对应的未知功能基因。因此，本论文构建了式根岛海绵（Discodermiacalyx）的宏基因组文库，对其进行功能筛选，检测到三株不同的活性克隆。对活性克隆进行后续的化学和序列信息研究，从液体培养液中鉴定出4个卟啉类化合物（1-4）及其对应的功能基因，3个脂肪酸化合物（5-7）及其相关的功能基因，8个吲哚类化合物（8-15）；从平板培养（固体培养）提取物中检测得到1个酰胺类化合物（16），分离出11个环二肽类化合物（17-27）。主要研究结果如下：①成功建立了式根岛海绵宏基因组文库，并从中得到3株不同的阳性克隆：抗蜡状芽孢杆菌（B.cereus）活性克隆pDC113，棕红色克隆pDC112和pDC114。②从棕红色克隆pDC112和pDC114检测分离到四个红色色素：粪卟啉III锌螯合物（1）、粪卟啉III（2）、原卟啉IX锌螯合物（3）和原卟啉（4）。其中1是主要色素，其结构由1HNMR，13CNMR，1H-1HCOSY，HMQC，HMBC，HRMS，UV数据确定。对克隆pDC112的插入DNA序列进行测定分析，鉴定出由40.639kb基因编码的31个假定的开放阅读框（ORF）。其中4个ORFs参与卟啉类化合物生物合成：细胞色素c型生源蛋白（261aa），谷酰胺tRNA还原酶（hemA，420aa），胆色素原脱氨酶（hemC，322aa）和胆色素原合酶（hemB，322aa）。pDC114的序列分析结果表明，其37.753kb序列编码的32个假定ORFs中，含有5个ORFs编码的蛋白与卟啉类化合物C5生物合成途径中形成线状或环状四吡咯的必需酶有很近的同源关系：前咕啉-4C（11）-甲基转移酶（175aa），钴胺生物合成酶（391aa），前咕啉-3B甲基酶（358aa），hemA（463aa），谷氨酸-1-半醛2，1-氨基变位酶（hemL，428aa）。hemA基因同时存在这2个克隆中，说明hemA可能是合成卟啉类化合物的一个必需的基因。卟啉类衍生物具有重要的医药和食疗价值，为了工程上使用E.coli生产卟啉类化合物及其衍生生物，从式根岛海绵继续开发其独特的生物合成酶基因，是有价值的。③从抗菌克隆pDC113的异源表达培养液中分离检测到3个β-羟基脂肪酸：3-羟基棕榈酸（5），3-羟基肉豆蔻酸（6）和3-羟基月桂酸（7）。5具有中等程度的抗菌活性（MIC，μg/mL）：B.cereus（6.25）和白色念珠菌（C.albicans，12.5）。对pDC113的插入DNA序列进行分析，结果表明其43.32kb序列编码42个假定的ORFs。其中23个假定的ORFs（共24.813kb）编码的蛋白参与脂肪酸和脂质A的生物合成，与细菌脂肪酸Ⅱ类合成酶和脂质A生物合成酶有很近的同源关系。6个ORFs编码的蛋白：脂肪酸/磷脂合成蛋白（plsX，376aa）、ACPS-丙二酰转移酶（fabD314aa）、fabG（253aa）、酰基载体蛋白质（ACP，81aa）、?-酮脂酰-ACP合成酶II（fabF，417aa）和?-羟基酰基-ACP脱水酶（fabZ，179aa），参与细菌Ⅱ型脂肪酸的生物合成。7个ORFs编码的蛋白：LpxD（344aa）、LpxA（269aa）、LpxB（391aa）、KdtA（434aa）、LpxK（379aa）、LpxL（285aa）和LpxM（285aa），参与脂质A的生物合成。23个ORFs中的其它ORFs可能是参与脂质A生物合成的跨膜蛋白。脂肪酸和脂质A的生物合成途径是抗微生物药物，尤其是抗耐药性细菌药物研发的很有吸引力的潜在靶点。海绵微生物及其有趣的基因将是这些药物靶点的独特来源。④从抗菌克隆pDC113的液体培养提取物的其它活性部位，还分离得到7个吲哚类化合物（8-14），其中12具有很强的抗菌活性。通过对克隆pDC113的序列分析，并没有明显发现它们的功能基因信息。在培养液中加入色胺培养pDC113，以检测化合物8的产量是否显著提高时，意外得到一个新的吲哚三聚体化合物15，并且活性（MIC，μg/mL）很好：对B.cereus（0.78），MSSA（0.78），C.albicans（6.25）和E.col（i1.52μg/mL）。25）都具有抗菌活性，并对小鼠白血病P388具有细胞毒性（IC50，⑤本实验也尝试了平板培养活性克隆pDC112和pDC113，得到与