炭疽杆菌gnmt和gale蛋白表达、纯化和结晶分析-expression, purification and crystallization analysis of gnmt and gale protein from bacillus anthracis.docxVIP

福建 福建农林大学硕士学位论文 HYPERLINK \l _bookmark0 2 实验材料、仪器与方法 17 HYPERLINK \l _bookmark1 2.1 材料与试剂 17 HYPERLINK \l _bookmark2 2.2 仪器与设备 17 HYPERLINK \l _bookmark3 2.3 实验方法 18 HYPERLINK \l _bookmark4 2.3.1 PCR、产物鉴定、DNA 的回收 19 HYPERLINK \l _bookmark5 2.3.2 质粒的抽提 21 HYPERLINK \l _bookmark6 连接及菌落 PCR 21 HYPERLINK \l _bookmark7 转化 22 HYPERLINK \l _bookmark8 2.3.5 配制 LB 液体培养基和平板 22 HYPERLINK \l _bookmark9 2.3.6 挑单菌落及扩大培养 22 HYPERLINK \l _bookmark10 2.3.7 大肠杆菌中诱导表达 23 HYPERLINK \l _bookmark11 2.3.8 镍柱重力洗脱纯化蛋白 23 HYPERLINK \l _bookmark12 2.3.9 SDS电泳检测 24 HYPERLINK \l _bookmark13 2.3.10 分子筛和离子交换柱层析操作步骤 24 HYPERLINK \l _bookmark14 2.3.11 蛋白质浓度测定 25 HYPERLINK \l _bookmark15 2.3.11 晶体生长 26 HYPERLINK \l _bookmark16 3 实验结果 27 HYPERLINK \l _bookmark17 3.1 GNMT 基因 PCR 扩增 27 HYPERLINK \l _bookmark18 3.2 GNMT 重组质粒鉴定 28 HYPERLINK \l _bookmark19 3.3 GNMT 目的蛋白的表达检测 29 HYPERLINK \l _bookmark20 3.4 GNMT 蛋白纯化 29 HYPERLINK \l _bookmark21 3.4.1 Ni-NTA 亲和层析纯化 30 HYPERLINK \l _bookmark22 3.4.2 Mono Q 离子交换层析柱纯化 30 HYPERLINK \l _bookmark23 3.4.3 分子筛层析柱纯化 31 HYPERLINK \l _bookmark24 3.5 蛋白质结晶 32 HYPERLINK \l _bookmark25 3.6 结晶优化 33 HYPERLINK \l _bookmark26 3.7 GalE 基因 PCR 扩增 35 HYPERLINK \l _bookmark27 3.8 GalE 重组质粒鉴定 36 HYPERLINK \l _bookmark28 3.9 GalE 目的蛋白的表达检测 37 HYPERLINK \l _bookmark29 GalE 蛋白纯化 37 HYPERLINK \l _bookmark30 3.10.1 Ni-NTA 亲和层析纯化 37 HYPERLINK \l _bookmark31 3.10.2 Mono Q 离子交换层析柱纯化 37 HYPERLINK \l _bookmark32 3.10.3 分子筛层析柱纯化 38 HYPERLINK \l _bookmark33 GalE 蛋白质结晶 39 HYPERLINK \l _bookmark34 GalE 结晶优化 40 HYPERLINK \l _bookmark35 4 讨论 42 HYPERLINK \l _bookmark36 4.1 引物的设计与 PCR 42 HYPERLINK \l _bookmark37 4.2 大肠杆菌克隆载体和表达载体 42 HYPERLINK \l _bookmark38 4.3 重组质粒的双酶切鉴定 43 HYPERLINK \l _bookmark39 4.4 重组蛋白的表达分离纯化 43 HYPERLINK \l _bookmark40 4.5 蛋白晶体生长 44 HYPERLINK \l _bookmark41 5 结论 46 HYPERLINK \l _bookmark42 参考文献 47 HYPERLINK \l _bookmark43 致 谢 53 PAGE PAGE 10 摘 要 炭疽属于造成死亡率很高的一类急性的人畜共患传染病。炭疽杆菌常常被用 作生化武器，对人类生存和生命安全存在威胁，因此炭疽杆菌的研究仍