色素原底物反应测定酶活性ppt课件.pptVIP

贵阳医学院医学检验系　黄海 实验 26 色素原底物反应测定酶活性 实验目的 掌握：色素原底物反应测定酶活性的原理。 熟悉：熟悉连续监测法测定实验的操作步骤。 了解：测定GGT、ALP和AMS的临床意义。 一、血清γ-谷氨酰基转移酶（GGT）测定 二、血清碱性磷酸酶（ALP）测定 三、血清淀粉酶（AMS）测定 实验原理 （黄色化合物，λ=405nm） 在405~410nm处监测吸光度变化。吸光度增高速率（ΔA/min）与GGT活性呈正比，利用连续监测法酶活性的计算公式，求出GGT活性。 一、血清γ-谷氨酰基转移酶（GGT）测定 试剂与器材 底物缓冲液 Tris-HCl缓冲液110mmol/L；双甘肽110mmol/L；L-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺6.0mmol/L；pH(37℃) 7.7。 2. 待测标本 病人血清或质控血清。 操作步骤 1. 手工操作 （1）37℃预温的底物缓冲液。 （2）在光径为1.0cm石英比色皿中加入血清100μl及预温的底物缓冲液1 000μl；在37℃，波长405nm连续监测60s吸光度的变化，求出ΔA/min。 操作步骤 2. 自动化生化分析仪操作程序的设置 按手工操作要求设置参数为： F值: 1 159； 延滞期时间: 30s； 连续监测时间: 60s； 比色皿光径: 1.0cm； 波长: 405nm； 吸样量: 100μl； 温度: 37℃ 计算 式中9 490为2-硝基-5-氨基苯甲酸在405nm处的摩尔消光系数。 参考范围 男性血清GGT: 11 U/L ~50U/L （37℃） 女性血清GGT: 7 U/L ~32U/L （37℃） 临床意义 1. GGT主要用于诊断肝胆疾病 原发性肝癌血清GGT活性显著升高，急性肝炎、慢性肝炎活动期、阻塞性黄疸、胆道感染、胆石症、急性胰腺炎时都可以升高。 2. 人体器官中GGT的含量按下列顺序排列：肾、前列腺、胰、肝、盲肠和脑。肾脏中GGT含量最高，但肾脏疾病时，血液中该酶活性增高不明显，可能是肾脏病变时，GGT经尿排出。 3. 嗜酒或长期接受某些药物如安替比林、苯巴比妥、苯妥英钠等，血清GGT活性常升高。 注意事项 1. 测定波长为405nm，2-硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔消光系 数，因仪器性能和精度不同存在差别，建议各实验室自 行测定。 2. 甘氨酸对GGT反应有抑制作用，所用的双甘肽制剂中甘 氨酸含量应0.1%。溶血标本对测定结果影响不大，黄 疸和脂血不干扰本法测定结果。 3. 血清GGT的活力在室温或4℃可稳定7天，在冷冻状态下 可稳定2个月。 评价 准确性和精确性都好，操作简便； 实验条件要求严格。 返回本实验目录 实验原理 二、血清碱性磷酸酶（ALP）测定 ALP速率法测定的反应式为： 黄色（405nm） 试剂与器材 1. 试剂组成 试剂Ⅰ（R1）： 1.00mmol/L二乙基氨基乙醇（EAE）缓冲液 、0.5mmol/L MgCl2。 试剂Ⅱ（R2）： 100mmol/L 4-NPP 、0.5mmol/L MgCl2。 若作单试剂法，可将试剂Ⅰ4份与试剂Ⅱ1份临用前混合成工作液。 试剂与器材 2. 生化分析仪测定条件 温度：37±0.1℃； 光径：1.0±0.01mm； 波长：405±1nm； 带宽：≤2nm。 操作步骤 单试剂法 标本10μl+工作液500μl 延迟时间60s 读数时间120s 计算 4-硝基酚（PNP）ε：18 500（405nm） 参考范围 成人血清ALP： 40 U/L ~150U/L 临床意义 1. ALP可作为肝胆和骨骼疾病的辅助诊断指标。 肝胆疾病，如阻塞性黄疸、急或慢性黄疸型肝 炎、肝癌等血清酶活力可增高。 发生骨骼疾病时，由于骨的损伤或疾病使成骨细 胞所含高浓度的ALP释放入血，引起血中ALP活 力增高。 2. ALP减少比较少见，主要见于呆小病、成骨不全 症、磷酸酶过少症、维生素C缺乏症等。 注意事项 1. 血清置室温（25℃），ALP活性显示轻度升高。 例如，室温6小时，酶活性约增高1%，置1~4天 酶活性增高3%~6%。血清存放冰箱（4℃），酶 活性也出现缓慢升高。冰冻血清，ALP活性降 低，但当血清复温后，酶活性会慢慢恢复。 2