肿瘤细胞培养和杂交瘤技术医学ppt课件.ppt

安徽医科大学微生物学教研室 龚蕴贞;一、肿瘤细胞体外培养的重要性 二、癌细胞系的建立 三、转化细胞系建立 四、癌细胞系和转化细胞系注意事项 五、癌细胞系和转化细胞系的鉴定 六、癌细胞和转化细胞系建立和鉴定的小结及讨论 ;一、肿瘤细胞体外培养的重要性 ;;癌细胞来源于体内正常上皮细胞。癌细胞在体内或体外一样具有无控制生长和分化不全的特点，因此比正常细胞容易培养建细胞系。如20世纪50年代，国外建立了宫颈癌的Hela细胞系。;;癌细胞的迅速增殖扩散受机体内环境中多种因素的影响如各种生长因子、抑素、激素、多胺、基因调节包括细胞周期基因和癌基因、cAMP和cGMP浓度（前者对细胞增殖负调节，而后者为相反）。;;体内细胞处于不同状态，大概分成三种命运: ①继续增殖细胞，不断离开G1期通过细胞周期中不同时期（S 、G2、M）完成细胞分裂，如骨髓干细胞，胃肠上皮中的基底细胞等， ②不增殖细胞，这类细胞在分裂完成后，暂处于G1期，正常情况下不合成DNA，不进入细胞分裂期，如肝细胞，只有受损或切除时肝细胞再分裂增殖。哺乳动物的初级卵细胞也属于此类。 ③不增殖细胞，这类细胞由R点走向分化细胞，并执行专门功能的细胞（称终末细胞）如神经细胞、哺乳动物成熟的红细胞、皮肤上皮的角质细胞、多性核粒细胞。 ;肿瘤和正常的组织同样在体内也具有三种不同的细胞群： ①增殖细胞群（A）：是肿瘤中处于增殖周期的细胞，与肿瘤生长直接有关，亦是化学疗法最易攻击的部分。 ;;;常应用体外肿瘤细胞培养，模拟体内环境或确定单因素多因素研究肿瘤细胞发生发展结局。观察抗癌药物对细胞周期作用点的影响也常应用肿瘤细胞体外培养。若能确定肿瘤细胞各周期时间，选择各期针对性药物进行治疗，则可以提高疗效。;;;;;当前较有前景的靶向治疗;当前较有前景的靶向治疗;②制备单克隆抗体，主要是靶向表皮生长因子EGF受体EGFR和HER-2。80年代研究人员发现，在人类的脑部、肺部和胰腺等部位的肿瘤中EGFR的含量极高，Artrazeneca公司的研究人员于1998年率先提出通过开发阻断EGFR的药物，可以抑制肿瘤的生长，这种全新的疗法就是现在的靶向性疗法，它没有???副作用，不会杀死正常细胞，按照这种思路，基因技术公司开发出一种治疗晚期乳腺癌的药物Herceptin，并于1998年获准上市。Herceptin是一种单克隆抗体药物，靶向HER-2，这种药物能使只有5个月寿命的晚期乳腺癌病人继续生存。为什么Herceptin成功获准，由于临床试验中没有同时对所有乳腺癌患者进行试验，而是选择了其中的一小部分（大约占25℅）的那些HER-2含量异常高的晚期乳腺癌患者。 ;Astrazeneca公司的肺癌药Iressa等都是靶向药物，靶EGFR，但成功的只有Herceptin。Iressa只在10℅肺癌患者中有神奇作用，但在大规模的临床试验中90℅人无效。花3亿美元，10年时间，未获批准。;;;二、癌细胞系的建立 ;;（一）癌细胞原代培养;1．标本收集和取材 ;;;2．分散癌组织 ;胰蛋白酶(trypsin)是最常应用的酶，但它对结缔组织的消化能力有限，适合含结缔组织较少的肿瘤，并且trypsin对细胞膜有损害作用，影响细胞存活。胶原酶消化癌组织证明更有效，可抑制结缔组织细胞的生长。 胶原酶的消化方法：0.5mg／ml胶原酶处理，可在显微镜下观察，纤维细胞逐渐被除去为止。用Hanks液或培养基洗涤，除去附着细胞的酶，再进行接种和培养。;;3．接种肿瘤细胞 ;4．成纤维细胞过度生长的去除 ;;;5．培养基 ;血清对上皮细胞有抑制作用有利于成纤维细胞生长。因此用低或无血清培养基为好。改良RPMI-1640培养基可提高癌细胞存活。 HITES选择培养基，加有氢化可的松（hydrocordisone）、胰岛素(insulin)、转铁蛋白(tramsferrin)、雌激素(estradiol)、硒(selenium)等成分。HITES培养基适合用于人小细胞肺癌建系。 Insulin、tramsferrin、selenium、hydrocordisone、EGF、BSA、和丙酮酸钠（sodium pyruvate）。为了抑制成纤维细胞生长，在培养基中加入成纤维细胞的抗体或成纤维细胞代谢抑制成分，也可提高癌细胞系建系率。 ;6．饲养层 ;;饲养层的制备;（二）癌细胞原代培养的换液和传代;1．换液;2．传代 ;;3．冻存和复苏 ;（三）人肺癌细胞建系;1、材料 ;2、方法 ;加入消化液（0.5%trypsin+0.04%EDTA）覆盖组织块。烧瓶放在磁力搅拌器上，缓慢搅拌15分钟。 重复步骤4，直到细胞组织块完全消化，收集消化液于瓶中。 吸出收集的消化液到另一个灭菌玻瓶中。 离心3000rpm，15分钟，弃上清。用含血清