曼方程最大反应速率底物浓度米氏常数反应速度一.PPT

第二十三章 临床酶学检验的原理和方法 * 临床酶学检验 基本特点 基本方法 1、项目多，应用广 2、含量少，难度大 3、高灵敏度 4、高特异度 1、活性测定法 2、质量测定法 第一节 酶活性测定的理论基础 一、酶促反应进程 二、定时法 三、连续检测法 米-曼方程 最大反应速率 底物浓度 米氏常数 反应速度 一、酶促反应进程 K1 K2 E + S ES E + P K-1 酶 底物 酶-底物复合物 酶 产物 Vmax［S］ V0 = Km +［S］ （一）Km Km是酶的特征性常数之一。若v=0.5Vmax，则Km=[S]，可见Km值等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半时的底物浓度。Km只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。 1．1／Km可近似地表示酶对底物的亲和力的大小，Km值越小，表示酶与底物的亲和力越大，反之亦然。 2．如果一个酶有几种底物，则对每一种底物各有一个特定的Km值，其中Km值最小的底物大都是该酶的最适底物或天然底物。 3．如已知酶的Km，可计算某一底物浓度时反应速率v和最大速率Vmax的比值，并可推知酶的活性中心被底物饱和的分数。同样，如要求v和Vmax有一定的百分比，也可算出所需底物浓度为其Km的多少倍 4．利用工具酶来测定体液中某一成分的浓度或某一酶的催化活性浓度时，可根据米-曼方程或其衍变方程式来计算工具酶的用量。 5．测定Km值可鉴别不同来源但催化相同反应的酶是同一种酶或是同工酶。 6．如一个酶催化正逆两个方向，测定正逆两个方向底物的Km及底物浓度，可大体推测该酶在体内催化反应的方向及其催化效率。 7．在代谢酶系中，当一组酶催化连续的代谢反应时，如已知各酶的Km及其相应底物的浓度，有助于寻找代谢的限速步骤。一般Km值最大的酶所催化的反应为该酶系的限速步骤。 （二）Vmax Vmax表示在一定酶量下的最大反应速率，即酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度呈正比。在酶的浓度不变时，对于特定底物而言，Vmax也是一个常数。 零级 一级 [P] [S] V ＝ dp dt 时间 延滞期 线性期 非线性期 酶促反应时间进程曲线 （一）延滞期 延滞期（lag phase）是指反应初开始的一段时间，可以是几秒至几分钟。此时[S]不断下降，随之有相应[P]产生。 由于多种因素的影响，该其酶促反应速率比较慢。 1、单一酶促反应的延滞期：是指酶促反应开始到达最大 反应速率所需要的时间。 2、酶偶联反应的延滞期 （二）线性期 延滞期后，在过量底物存在的条件下，酶促反应速率达到最大反应速率并保持相对恒定的一段时期，该期在时间进程曲线中呈直线或接近直线状态，称为线性期( linear phase )。 因底物量足够，在线性期酶促反应速率不受底物浓度的影响，产物[P]和底物[S]变化与时间t成直线关系，因此该期的酶促反应速率能反映酶活性的大小。 （三）非线性期 非线性期又称底物耗尽期，是指线性期后反应速度明显下降，酶促反应进程曲线偏离直线的一段时期。 根据酶促反应进程曲线中线性期的反应速度才能准确计算出酶活性浓度，因此，不论哪种酶活性浓度测定方法，都应该尽量保证在酶促反应进程的线性期进行检测，否则将导致误差。在延滞期、非线性反应期所测得的结果往往不准确。 二、定时法 为了计算酶活性浓度，必须根据线性反应期（零级反应期）的反应速率才能准确计算出酶活性浓度，否则将导致误差。 酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度达到Vmax，即在过量底物存在下的零级反应期的V，此时V与[E]之间有线性关系。 酶活性浓度测定方法 ①量气法 其原理是通过测量一封闭反应系统中气体变化后的气体体积或压力，从而计算出气体的变化量 适用于测定在反应中产生或 消耗气体的酶 ②分光光度法 酶促反应的底物与产物结构不同，光吸收谱也有差异，不仅能在可见光范围测定有色溶液的浓度，还能在紫外光波长范围测定特异的带有双键或环状结构的无色物质 ③荧光法和放射性核素法 通过荧光光度计测定酶促反应生成荧光物质的速率，此速率与酶浓度成正比 ④其它方法 1.按监测方法分类 2.按反应时间分类 (1)定时法（取样法、终点法、两点法） (2)连续监测法（动力学法、速率法） 定时法（取样法、终点法、两点法） 定时法:早期测定酶活性浓度的方法，大多是使酶作用一段时间，然后加入强酸、强碱、