人剪切修复基因xpd对肝癌细胞中p53和ets-1基因的作用-effects of human shear repair gene xpd on p53 and ets - 1 genes in hepatocellular carcinoma cells.docx

摘要目的：将野生型XPD基因通过质粒转入人肝癌细胞HepG2中，再加入p53抑制剂Pifithrin-α（PFT-α），观察基因XPD、p53、Ets-1的表达变化和对细胞增殖活力的影响。方法：1、复苏购买于美国模式菌种收集中心的人肝癌细胞HepG2，采用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养液培育、传代、冻存菌种；2、将含有pEGFP-N2空载质粒（N2质粒）（从美国Clontech公司购买）和pEGFP-N2-XPD重组质粒（XPD质粒）（由本实验室构建）的JM-109大肠杆菌的菌液，分别进行摇菌扩增；3、使用质粒提取试剂从菌液中分别提取N2质粒、XPD质粒；4、设置6个实验组，1组：空白对照组、2组：脂质体对照组、3组：pEGFP-N2组、4组：pEGFP-N2-XPD组、5组：pEGFP-N2-XPD+Pifithrin-α组、6组：Pifithrin-α组。5、使用瞬时转染技术，将质粒转染至细胞中，以空白组做对照，利用荧光显微镜，察看细胞中绿色荧光蛋白的表达，24h后加入p53抑制剂Pifithrin-α（PFT-α），在孵育24h后收集细胞；6、提取HepG2细胞总RNA，经过逆转录为cDNA，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞中XPD、p53、Ets-1的mRNA表达变化；7、提取细胞总蛋白，用蛋白印记法（Westernblot）检测XPD、p53、phospho-p53(ser-15)、Ets-1蛋白表达的变化。8、使用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）观察HepG2细胞增殖的活力，流式细胞仪检测HepG2细胞周期变化。结果：1、转染N2空载质粒和XPD重组质粒后，在绿色荧光显微镜下，细胞表达出大量绿色荧光。2、利用RT-PCR方法检测mRNA表达，转染XPD重组质粒后，与空白对照组相比，XPD、p53的mRNA表达水平上升（P0.01），Ets-1表达下降（P0.01）；在加入Pifithrin-α（PFT-α）后，与pEGFP-N2-XPD重组质粒组比较，Ets-1表达出现部分上升（P0.01），XPD、p53没有明显变化。3、使用Westernblot检测蛋白表达，转染XPD重组质粒后，与空白对照组相比，XPD、p53、p-p53蛋白表达水平增加（P0.01），Ets-1蛋白水平下调（P0.01）；加入Pifithrin-α后，与pEGFP-N2-XPD组比较，p-p53蛋白表达明显下降，Ets-1II出现上升（P0.01），而XPD、p53没有明显变化。4、MTT法观察细胞，将XPD质粒转染至细胞后，增殖能力下降，加入Pifithrin-α（PFT-α）后出现部分上升（P0.01）。5、流式细胞仪检测细胞周期显示，转染XPD质粒后，HepG2细胞进入S期发生阻滞，停滞在G1期，加入PFT-α后阻滞作用减弱。结论：将野生型XPD基因转染至HepG2细胞中，促使p53表达上调，同时抑制了原癌基因Ets-1的表达；加入p53抑制剂后，这种作用被部分逆转了，可以认为XPD的作用是通过p53来对Ets-1基因的表达进行调控的。转染野生型XPD基因后，肝癌细胞的增殖下降，细胞周期停滞，凋亡增加。这些研究均为肿瘤的基因治疗提供实验依据。关键词肝细胞癌；着色性干皮病蛋白质D组；转染；p53基因；Pifithrin-α；原癌基因蛋白质Ets-1IIIABSTRACTObjective:Wetransfectedtherecombinationplasmidwithwild-XPDintohumanhepatomacells(HepG2),thenincubatedHepG2withPifithrin-α(p53inhibitor).WedetectedthechangesabouttheexpressionlevelsofgeneXPD,p53,Ets-1,andthecellularviability.Methods:HepG2cellsboughtfromAmericanTypeCultureCollection(ATCC)wererevivedandculturedinDulbecco’smodifiedEagle’smedium(DMEM)containing10%Fetalbovineserum(FBS).ThepEGFP-N2plasmidsandpEGFP-N2-XPDplasmidswereextractedfromtheproliferatedcolibacilluses.Usingliposome,wetransfectedthetwoplasmidsintoHepG2.OneofthecellstransfectedwithpEGFP-N2-XPDplasmidswereincubate