体外致敏 dc 联合 cpg odn 对结肠癌免疫杀伤效应的研究-study on immune killing effect of in vitro sensitized dc combined with cpg odn on colon cancer.docxVIP

三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名：日期：三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认：我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺：我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第一作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。学位论文作者签名：日期：内容摘要目的：体外诱导扩增小鼠骨髓来源的树突状细胞（DC），利用含胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸(CpGODN)和/或结肠癌CT26细胞冻融物刺激并致敏，制成树突状细胞疫苗，再在体外激活杀伤性T细胞（CTL），观察其对结肠癌CT26细胞的免疫杀伤效应。探索刺激DC成熟并增强DC疫苗的免疫效应的新方法，为临床应用提供参考。方法：(1)无菌采用小鼠骨髓来源造血干细胞在rmGM-CSF和rmIL-4的联合诱导下产生DC，用CpGODN及结肠癌CT26细胞冻融抗原联合或单独作用于DC，观察树突状细胞的形态学变化，流式细胞仪测定其表面分子CD83、CD86的表达情况；MTT法检测不同处理组DC刺激单个核细胞增殖能力；(2)ELISA方法测定DC细胞培养上清液中IL-12、IFN-γ的分泌水平；不同处理组DC分别与同种异体脾细胞(单个核细胞)共同培养，诱导CTL，MTT检测各组CTL作用于CT26细胞的杀伤活性，并利用Annexin-Ⅴ方法测定细胞凋亡。结果：(1)光镜观察显示刺激组骨髓来源的树突状细胞比未刺激组树突状细胞突起多，而且突起出现的早，尤以应用CpGODN联合冻融抗原刺激组形态上最为典型。同时CpGODN联合肿瘤冻融抗原刺激的DC表面共刺激分子CD83,CD86表达水平较其他组也有明显升高(p＜0.05)。MTT法检测不同处理组刺激单个核细胞增殖能力有明显差异(p＜0.05)。(2)ELISA方法显示CpGODN联合冻融抗原刺激DC分泌IL-12及IFN-γ水平较其它刺激组增高(p＜0.05)。MTT法、Annexin-V法显示CpGODN联合肿瘤冻融抗原刺激组DC激活的CTL可以致肿瘤细胞凋亡(p＜0.05)。结论：(1)CpGODN可以刺激DC形态和功能的成熟，能使DC表面共刺激分子CD83、CD86表达明显升高；(2)CpGODN与肿瘤冻融抗原联合刺激的DC疫苗可以更有效地激活CTL，提高其抗肿瘤效应；(3)CpGODN与肿瘤冻融抗原联合冲击的DC疫苗能刺激DC分泌更高水平的IL-12、IFN-γ等细胞因子，更有效地促进同种异体T细胞增殖，诱导结肠癌细胞凋亡。关键词：DCCpGODN结肠癌AbstractObjectiveDendriticcell(DC)canbestimulatedandsensitizedbyCpGOligodeoxynucleotieds(CpGODN)withorwithoutcoloncarcinomaCT26freeze-lysatedtumorcell，afterisolatedandpurifiedDCfromBALB/cmice’sbonemarrow.TheseDCvaccinesthenactivateandtriggertheCytotoxicTLymphocytes(CTL)invivowhichfightagainstthecoloncaciinomaCT26cellline,andthenexplorethenewmethodsthatstimulateinmatureDCintomatureDCandtherebyenhancetheeffectionofDCvaccine,finallyprovidereferencesforclinicalapplication.Methods(1)DCsderivedfrombonemarrowwereisolatedandinducedundertheinductionofrmGM-CSFandrmIL-4,thenpulsedbyCpGODNandcoloncaciinomaCT26Cellfreeze-lysatedantigenaloneortogether.AndmorphologychangesofDCwereobservedbyl