下调c-flip在恶性黑素瘤细胞系中的表达诱导jnk信号途径活化的分析-analysis of down-regulating expression of c - flip in malignant melanoma cell line inducing activation of jnk signaling pathway.docx

中摘要文第一部分c-FLIP在黑素瘤组织中的表达及其与临床病理特征的关系目的检测c-FLIP在黑素瘤组织及细胞系中的表达，探究其与临床病理特征之间的关系。方法免疫组化方法检测c-FLIP在77例黑素瘤组织及23例色素痣组织中的表达；并检测其在34例CA和16例正常包皮组织中的表达，同时用westernblotting和RT-PCR检测了其分别在CA和正常包皮组织中的蛋白表达和mRNA水平。westernblotting和流式细胞术检测c-FLIP在A375，A875，SK-Mel-1和SK-Mel-28黑素瘤细胞系中的表达。结果c-FLIP在恶性黑素瘤组织中的表达明显高于在色素痣中的表达，其高表达与组织病理学分型相关并与黑素瘤的Clark’s分级相关。与Ki-67标记指数(KI)高度相关。四株黑素瘤细胞中，A875细胞的c-FLIP的表达最高。c-FLIP在CA中的蛋白和mRNA水平均较正常包皮组织中的明显增高。结论c-FLIP除了具有抗凋亡功能外，它还具有促增殖作用，在恶性黑素瘤的侵袭性生物学特性中可能具有重要的作用，对恶性黑素瘤的预后具有重要意义。c-FLIP在CA中的高表达可能与角质形成细胞的过度增殖有关。关键词MM；c-FLIP；临床病理特征；CA；增殖第二部分c-FLIPshRNA载体的构建及鉴定目的构建针对c-FLIP不同亚型的shRNA真核表达载体c-FLIPT/L/SshRNA，鉴定其正确性，并转染恶性黑素瘤A875细胞系，证实其在体外培养的恶性黑素瘤细胞中对c-FLIP具有干扰作用。方法①人工合成互补并编码相应短发夹状c-FLIPT/L/SshRNAs的寡核苷酸链，将其插入到Pgenesil-1载体中，经酶切和测序鉴定所构建的重组体是否正确；②采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、Westernblot和流式细胞术分别检测转染的A875细胞中c-FLIPmRNA和蛋白的表达变化。③在人恶性黑素瘤细胞系A875中，用G418筛选沉默效果最佳的c-FLIPshRNAs，用流式细胞术(FCM)检测GFP的表达,鉴定稳定转染的单克隆细胞系。结果①经酶切和测序证明c-FLIPT/L/SshRNAs序列正确；②A875细胞系中转染c-FLIPT/L/SshRNAs载体后，c-FLIPT1shRNA和c-FLIPL1shRNA沉默效果最佳。③荧光显微镜下观察到了G418筛选稳定表达c-FLIPT1shRNA的A875细胞，FCM检测GFP表达均在96%以上。结论测序结果表明发卡样的c-FLIPT/L/SshRNAs真核表达载体构建成功，转染A875细胞后获得稳定表达，并可特异性封闭c-FLIPT/L/S的表达，筛选和鉴定出稳定转染单克隆细胞系A875，为后续实验及进一步研究c-FLIPT/L/SshRNAs载体在恶性黑素瘤治疗中的作用提供了理论基础。关键词RNA干扰；c-FLIP；c-FLIPT/L/SshRNAs；MM第三部分c-FLIP的下调诱导恶性黑素瘤A875细胞系JNK信号途径的活化目的观察c-FLIP不同亚型shRNA对恶性黑素瘤A875细胞系JNK信号途径的影响。方法westernblot检测c-FLIPT/L/SshRNAs真核表达载体稳转的A875细胞系中p-JNK表达水平。结果与未转染质粒的A875细胞和稳定转染c-FLIPCshRNA真核表达载体的A875细胞相比，c-FLIPT/LshRNAs真核表达载体稳定转染的A875细胞系中p-JNK表达水平明显升高，而c-FLIPS-shRNA真核表达载体稳转的A875细胞系中p-JNK表达水平无明显变化。结论在黑素瘤细胞系中下调c-FLIP（c-FLIPL）的表达可以诱导JNK信号途径的活化。关键词c-FLIPT/L/SshRNA；JNK信号途径；MM第四部分c-FLIP不同亚型shRNA对恶性黑素瘤细胞生物学特性的影响目的观察c-FLIP各亚型shRNA对A875细胞的生长、增殖及凋亡的影响。方法在c-FLIPT/L/S/CshRNA稳定转染A875细胞中，运用绝对细胞计数对c-FLIP各亚型shRNA稳定转染细胞绘制生长曲线，比较其与对照组的差异；用MTT法检测各稳定转染细胞增殖能力的差异；用Annexinⅴ/PI双染细胞，检测各组细胞凋亡率的差异。结果稳定转染c-FLIPT/L/SshRNAA875细胞生长速度较未转染质粒的A875细胞和稳定转染c-FLIPCshRNAA875细胞的生长速度慢，进入对数生长期的时间延长且平台降低。与未转染质粒的A875细胞和稳定转染c-FLIPCshRNA真核表达载体的A875细胞相比，稳定转染c-FLIPT/L/SshRNA真核表达载体的A875细胞光密度值明显降低。运用Annexinⅴ/PI双染，流式细胞术检测