慢病毒载体mirna sponge介导mir-17 mir-20a基因沉默的抗白血病作用机制研究-慢病毒载体mirna sponge介导mir 第十七20a 基因沉默的抗白血病作用机制研究.docxVIP

目录英文略缩词………………………………………………………….…..…….…2中文摘要…………………………………………………………….…...…….…3英文摘要…………………………………………………………….…………6前言………………………………………………………………….…………7第一部分miR-20aSponge载体构建及在白血病细胞株Jurkat中的表达引言…………………………………………………………….…………10材料………………..…………………………...……………...……..……..11方法……………………………………………………….…………………….15结果…………………………………………………………….………..…21讨论……………………………………………………………….……..…25结论……………………………………………………………………..…28第二部分miRNASponge介导miR-17、miR-20a基因沉默的抗白血病作用引言…………………………………………………………………..……29材料……………………………………………………………..…………30方法……………………………………………………..……………….30结果……………………………………………………………..…………32讨论………………………………………………………………..………35结论………………………………………………………………………37全文总结……………………………………………………………..…………38参考文献…………………………………………………………...39综述DNA甲基化-microRNA在多发性骨髓瘤中的研究进展43致谢………………………………………...………………………………………...511英文略缩词(Abbreviationsandacronyms)英文略缩词英文全称中文译名miRNASpongemiRNASpongemiRNA海绵ControlControl对照组GFPGreenFluorescentProtein绿色荧光蛋白3’UTR3’untreatedregion3’非翻译区qRT-PCRReal-timeQuantitativeReverseTranscriptionPCR实时荧光定量PCRddH2Odoubledistilledwater双蒸水mRNAmessengerRNA信使RNALBLuria-BertainmediumLB培养基cDNAcomplementaryDNA互补DNACCK-8CellCountingKit-8细胞计数试剂盒Tristris(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TEMEDetramethylethylenediamine四甲基乙二胺WBWesternBlot蛋白质免疫印迹PBSPhosphateBufferedSolution磷酸盐缓冲液DEPCdiethylpyrocarbonate二乙基焦磷酰胺TBSTTris-BufferedSalineTween-20三羟甲基氨基甲烷缓冲液ALAcuteleukemia急性白血病AMLAcutemyeloidleukemia急性髓系白血病ALLAcutelymphoblasticleukemia急性淋巴细胞白血病MMMultipleMyeloma多发性骨髓瘤DNMTsDNAmethyltransferaseDNA甲基转移酶2慢病毒载体(miRNASponge)介导miR-17、miR-20a基因沉默的抗白血病作用机制研究摘要目的：构建miR-20a基因的miRNASponge载体，建立Jurkat-S稳定细胞株，为进一步研究miR-20a功能及应用干扰技术治疗奠定基础；检测急性白血病患者中miR-17、miR-20a前体的表达情况并探讨miRNASponge介导的miR-17、miR-20a沉默的抗白血病作用机制。方法：设计、合成一对含有2个重复针对miR-20a成熟序列第9-12碱基错配的序列，并带有酶切位点，退火后连接到pCDNA3.0-L表达载体上；载体双酶切后再与退火产物连接，重复4次，酶切及荧光素酶活性鉴定；亚克隆到慢病毒表达载体，与psPAX2、PMD2G共转染HEK293T细胞，包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度，感染高表达miR-17、miR-20a的Jurkat细胞株；应用real-timePCR和Westernblot技术分别检测Jurkat-S稳定细胞中P21及E2F1mRNA和蛋白水平的表达，并与对照组进行比较；CCK-8方法及流式细胞仪方法分别检测miR-17、miR-20a沉默对Jurkat细胞增殖能力及细