题名合成新型荧光探针用于活细胞内双多巯基蛋白的检测及成像分析-novel fluorescent probe synthesized by title for detection and imaging analysis of dimercapto protein in living cells.docx
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题名合成新型荧光探针用于活细胞内双多巯基蛋白的检测及成像分析-novel fluorescent probe synthesized by title for detection and imaging analysis of dimercapto protein in living cells
独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得(注:如没有其他需要特别声明的,本栏可空)或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名:学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名:导师签字:签字日期:20年月日签字日期:20年月日目录摘要iAbstractiii第一章绪论11还原性物质的生理病理意义及检测技术11.1还原性物质的生理病理意义11.2硫醇类物质的检测技术22蛋白质的生理病理意义及检测技术62.1蛋白质概述62.1.1蛋白质的生理功能62.1.2蛋白质的病理意义82.1.3巯基蛋白的病理意义82.2蛋白质的检测方法92.3蛋白质的荧光标记策略92.3.1蛋白质标签法102.3.2酶融合标签法122.3.3酶底物融合标签法152.3.4短肽标签法182.3.5小分子直接标记法222.4巯基蛋白荧光检测方法232.4.1单巯基蛋白的检测方法232.4.2双巯基蛋白的检测方法243论文选题目的及意义27参考文献29第二章基于马来酰亚胺构建的一种新型荧光探针用于巯基类物质的检测391前言392实验部分412.1试剂与仪器412.2荧光探针的合成42探针O-Dm-Ac的合成42探针M-Dm-Ac的合成432.3实验方法442.3.1荧光探针O-Dm-Ac与M-Dm-Ac的配制442.3.2待测物质的配制442.3.3各种活性分子的配制452.3.4谷胱甘肽GSH的测定452.3.5探针O-Dm-Ac与一系列双巯基小肽序列响应情况比较45I目录2.3.6动力学452.3.7干扰物质的测定463结果与讨论463.1反应机理463.2探针与GSH体系473.2.1探针对GSH的荧光响应473.2.2探针O-Dm-Ac与GSH响应的线性关系483.2.3探针与GSH动力学实验493.3探针O-Dm-Ac与双巯基小肽序列体系503.3.1探针O-Dm-Ac与一系列双巯基小肽序列的响应503.3.2探针O-Dm-Ac与小肽序列W-7实验参数的优化523.3.3探针O-Dm-Ac与W-7肽响应的线性关系543.3.4探针O-Dm-Ac与W-7肽动力学实验553.4探针O-Dm-Ac选择性的评价554结论57参考文献58第三章基于马来酰亚胺构建的一种新型荧光探针用于双(多)巯基蛋白的检测621引言622实验部分642.1试剂与仪器642.2实验方法642.2.1荧光探针O-Dm-Ac与M-Dm-Ac的配制642.2.2待测物质的配制642.2.3巯基蛋白BSA及rBSA的测定652.2.4探针O-Dm-Ac与rBSA响应的线性关系662.2.5探针O-Dm-Ac与BSA及rBSA动力学实验662.2.6探针与BSA及rBSA的凝胶电泳实验662.3细胞培养68HepG2肝癌细胞的培养68MTT实验682.3.3激光共聚焦成像683结果与讨论693.1反应机理69探针O-Dm-Ac和M-Dm-Ac与巯基蛋白BSA及rBSA的响应69探针O-Dm-Ac与BSA和rBSA响应情况的比较69探针M-Dm-Ac与BSA和rBSA响应情况的比较713.2.3探针O-Dm-Ac与rBSA响应的线性关系713.2.4探针O-Dm-Ac与BSA及rBSA动力学实验72II探针O-Dm-Ac与M-Dm-Ac和BSA/rBSA的凝胶电泳实验733.4探针O-Dm-Ac细胞毒性评价743.5细胞内双(多)巯基蛋白的激光共聚焦成像754总结76参考文献77攻读硕士学位期间参与的课题和发表的论文82致谢83III摘要摘要生物体内还原性物质在维持和调节生物体的氧化还原内环境起着重要的作用。许多研究表明还原性物质对于机体具有抗氧化防御作用,而且还具有其他一些生理功能,如解毒、增强免疫力、延缓衰老及抗癌。由于还原性物质具有氧化还原调控的重要作用,因此就必须设计出一些适用于细胞内还原物种的高选择性、高灵敏度检测的小分子荧光探针,用于细胞内还原物种的识别、定量。蛋白质是生物体最重要的组成成分之一,是生命活动的重要参与者。蛋白质种类极其繁多,分布极其广泛,所具有的功能也各不相同。生物体内的很多生理和病理现象都与蛋白质的病变有关,如亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默病、帕金森病以及癌症
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