系统性红斑狼疮患者糖皮质激素冲击治疗前后tcrβ链cdr3受体库的特征和变化分析-characteristics and changes of tcr β chain cdr 3 receptor library in systemic lupus erythematosus patients before and after glucocorticoid shock therapy.docx

PAGE PAGE 2 系统性红斑狼疮患者糖皮质激素冲击治疗前后 TCR β 链 CDR3 受体库特征和变化分析 中文摘要 目的： 采用 Illumina Solexa 高通量测序技术，探讨系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus, SLE）患者大剂量糖皮质激素冲击治疗前后三个不同时间点（治疗前、 治疗后第一个月、治疗后第三个月），外周血 T 细胞 TCR β 链 CDR3 受体库的特征和 变化。 方法： 1 从遵义医学院附属医院肾病风湿科住院患者中，根据美国风湿病学会 2011 年修订 的 SLE 诊断标准和 SLEDAI 活动指数评分标准，遵从患者知情同意原则下，筛选 2 名 SLE 活动期志愿患者。 2 2 例 SLE 活动期的志愿患者：Patient 1（P1）；Patient 2（P2），在糖皮质激素冲击 治疗前、治疗后第一个月和治疗后第三个月时，每次采集外周血量 5ml，同时检测患 者外周血白细胞数量及抗核抗体谱水平。 3 分离各外周血液样本中单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell ,PBMC），分 别提取各样本的总 DNA。各样本序号命名为：P1-0：患者 1 治疗前样本；P1-1：患 者 1 治疗后一个月样本；P1-3：患者 1 治疗后三个月样本；P2-0：患者 2 治疗前样本； P2-1：患者 2 治疗后一个月样本；P2-3：患者 2 治疗后三个月样本。 4 按照人 T 细胞 TCR β链 CDR3 受体库建库原理，采用多重 PCR 技术对各样本的 总 DNA CDR3 区扩增建库，采用 Illumina Solexa 高通量测序技术分别测定这三个不 同时间点的 TCR β 链 CDR3 受体库基因序列（建库和测序由美国华盛顿医学院 Adaptive Biotechnologies immunoSEQ 完成）。 5 T 细胞 TCR β链 CDR3 受体库的组成和特征分析：测序后所得各个样本的序列 转化为 FASTA 格式（又称 Pearson 格式，为核苷酸序列或氨基酸序列的格式），提交 至 IMGT/HighV-QUEST 在线软件，对上传后得 IMGT summary 文件，分析各样本 T 细胞 TCR β 链 CDR3 受体库的克隆多样性，TRBV、TRBJ 基因家族分布及 CDR3 区 的特征变化等。 结果： 1 2 例 SLE 志愿患者三个时间点血清抗核抗体水平： P1-0：抗 ds-DNA 抗体(+++)、抗 RNP/SM 抗体（++）、抗 SSA 抗体（++）； P1-1：抗 ds-DNA 抗体(+++)、抗 RNP/SM 抗体（++）、抗 SSA 抗体（++）； P1-3：抗 ds-DNA 抗体(+++)、抗 RNP/SM 抗体（+++）、抗 SSA 抗体（+++）； P2-0：抗 ds-DNA 抗体(+)、抗 RNP/SM 抗体（-）、抗 SSA 抗体（-）； P2-1：抗 ds-DNA 抗体(+++)、抗 RNP/SM 抗体（++）、抗 SSA 抗体（+）； P2-3：抗 ds-DNA 抗体(++)、抗 RNP/SM 抗体（+++）、抗 SSA 抗体（-）。 2 例 SLE 志愿患者三个时间点白细胞数目： P1-0：WBC 7.3×109 个/L、P1-1：WBC 4.7×109 个/L、P1-3：WBC 7.1×109 个/L； P2-0：WBC 5.8×109 个/L、P2-1：WBC 3.6×109 个/L、P2-3：WBC 7.9×109 个/L。 2 2 例 SLE 志愿患者三个时间点，PBMC 的总 DNA，在琼脂糖凝胶电泳图上，每个 样本 DNA 预 测 位 置 均 出 现 清 晰 的 条 带 。 样 本 经 美国 华 盛 顿 医 学 院 Adaptive Biotechnologies ImmunoSEQ 检测，六个样品各个总 DNA 量达 2ug 以上，符合建库和 Illumina Solexa 高通量测序要求。 3 六个样本 T 细胞 TCRβ链 CDR3 高通量测序原始序列数：原始序列总数/总 Productive 序列数/独特的 CDR3 序列数，分别是：P1-0：884760 条/731401 条/34130 条； P1-1：1539362 条/1268445 条/38849 条； P1-3：1654320 条/ 1371381 条/23553 条；P2-0：1219887 条/994323 条/24527 条；P2-1：811161 条/660616 条/22632 条；P2-3： 979612 条/794783 条/32190 条。 4 六个样本TCR CDR3受体库