小鼠il-33干扰rna逆转录病毒表达载体的构建及其对吸烟引起的小鼠肺部炎症的作用-construction of mouse il - 33 interfering rna retrovirus expression vector and its effect on lung inflammation caused by smoking in mice.docxVIP

4.1 实验材料……………………………………………………………………………26 4.1.1 实验动物和香烟……………………………………………………………26 4.1.2 实验试剂……………………………………………………………………26 4.1.3 实验器材……………………………………………………………………26 4.1.4 溶液的配置…………………………………………………………………27 4.2 实验方法……………………………………………………………………………28 4.2.1 小鼠急性肺炎模型的建立…………………………………………………28 4.2.2 组织标本的制备……………………………………………………………28 4.2.3 RT-PCR………………………………………………………………………29 4.2.4 免疫组织化学染色…………………………………………………………31 4.2.5 HE 染色 ……………………………………………………………………32 4.3 实验结果……………………………………………………………………………32 4.3.1 RT-PCR 的结果和干扰效果…………………………………………………32 4.3.2 免疫组织化学的结果………………………………………………………32 4.3.3 HE 染色的结果………………………………………………………………33 4.4 小结…………………………………………………………………………………34 结论与展望……………………………………………………………………………………36 参考文献………………………………………………………………………………………38 综述……………………………………………………………………………………………42 致谢…………………………………………………………………………………………50 发表论文………………………………………………………………………………………51 个人简历………………………………………………………………………………………52 汕头大学医学院硕士学位论文 汕头大学医学院硕士学位论文 中文摘要 IL-33（inteleukin 33，IL-33）作为IL-1家族的一员，与其特异性受体ST2结合，参 与固有免疫和获得性免疫。IL-33主要通过促进Th2细胞免疫反应，在自身免疫疾病、变态 反应性疾病、心血管疾病和神经退行性疾病等的发生发展中起重要的作用。 HYPERLINK /view/626266.htm 慢性阻塞性肺 HYPERLINK /view/626266.htm 疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是一组以肺实质与小气道受到 病理损害后，导致慢性不可逆性气道阻塞、呼气阻力增加、肺功能不全为共同特点的肺疾 病的总称。吸烟是COPD发病的重要因素。 为了研究IL-33下调对相关炎症反应的影响，本研究应用RNA干扰技术（RNA interference, RNAi）特异性下调小鼠IL-33 mRNA和蛋白的表达，探讨IL-33下调在吸烟 诱导的小鼠急性肺炎模型中的作用。研究内容如下： 一、根据GenBank中小鼠IL-33 mRNA序列（AY905582），按照RNA干扰序列设计原则， 运用GenScript公司的siRNA design center siRNA Target Finder设计针对小鼠IL-33的 小干扰RNA（small inteference RNA, siRNA），同时加入酶切位点XhoI和MluI，由上海 生工生物工程有限公司合成编码siRNA序列的DNA单链。 二、运用基因克隆技术，将化学合成的靶向小鼠IL-33基因的短发卡RNA（small hairpin RNA, shRNA），与逆转录病毒载体pRNATin-H1.4/Retro连接。经测序鉴定，重组载体中插 入的shRNA序列和设计序列一致，证明我们成功构建了小鼠IL-33 RNAi逆转录病毒载体。 空逆转录病毒载体作为阴性对照，经脂质体Lipofectamine2000转染病毒包装细胞PT67， 并以潮霉素B（Hygromycin B）筛选得到稳定转染细胞系，收集、保存病毒上清。 三、收集的病毒上清经尾静脉注射作用于实验小鼠。应用反转录聚合酶链反应技术 （ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction， RT-PCR ） 检 测 IL-33 mRNA （ messenger RNA,mRNA ） 在 肺 组 织 的 表 达 ， 应 用 免 疫 组 织 化 学 技 术 （Immunohistochemistry,IHC）检测IL-33蛋